WSPÓ CZESNA DIAGNOSTYKA WIRUSOLOGICZNA

Transkrypt

1 WSPÓ CZESNA DIAGNOSTYKA WIRUSOLOGICZNA Marek Tomasz Szkoda Wirusolog pos ugujàc si ró norodnymi metodami laboratoryjnymi musi odpowiedzieç na pytanie, czy okreêlone zaka enie wywo ane jest przez czynnik wirusowy, i w miar mo liwoêci zidentyfikowaç go jak najdok adniej. Post powanie lekarzy i mikrobiologów w przypadku wystàpienia zachorowaƒ zakaênych jest takie samo, niezale ne od tego, czy zachorowanie zosta o wywo ane zawleczeniem choroby z innego rejonu geograficznego, czy te jest to zachorowanie powsta e w wyniku ataku terrorystycznego z wykorzystaniem broni biologicznej. W przypadku masowych lub wysoce zakaênych zachorowaƒ ogromne znaczenie ma wczeêniejsze przygotowanie planów dzia ania s u b medycznych: wprowadzenie post powania profilaktycznego szczepieƒ, je eli jest to mo liwe, oraz wdro enie wêród personelu zasad rutynowego post powania medycznego minimalizujàcego rozprzestrzenianie si zaka eƒ. Sta a obserwacja i sprawny system szybkiego raportowania epidemiologicznego oraz praca s u b wywiadowczych, rozpoznajàcych potencjalne zagro- enia, mo e zapobiec katastrofie i wybuchowi epidemii. Szczepienia profilaktyczne umieszczone w kalendarzu szczepieƒ, ró ne w poszczególnych krajach, odpowiadajà skali zagro eƒ populacji ludzi yjàcej w okreêlonych warunkach na danym obszarze. Wprowadzenie masowych szczepieƒ profilaktycznych przeciwko wszystkim znanym patogenom nie jest mo liwe z powodu opracowania szczepionek tylko dla niewielkiej liczby patogenów. Szczepienie populacji przy u yciu wszystkich znanych szczepionek nie jest mo liwe ze wzgl dów medycznych, jak te ekonomicznych. Mo liwe jest rozszerzenie szczepieƒ profilaktycznych o wybrane patogeny w stosunku do personelu wyznaczonych szpitali lub cz Êci grup zawodowych, takich jak: personel medyczny, pracownicy laboratoriów, policja, stra po arna 77

2 itp. Od wirusologów wymagane jest potwierdzenie lub wykluczenie postawionego przez klinicyst rozpoznania czynnika zakaênego. Badania diagnostyczne powinny opieraç si na wynikach badaƒ wykorzystujàcych ró ne metody diagnostyczne. W poczàtkowym okresie diagnoza mo e byç postawiona jedynie na podstawie badania klinicznego. Czynniki zakaêne zastosowane jako broƒ, szczególnie w postaci aerozolu, ze wzgl du na krótki okres inkubacji i istotne niebezpieczeƒstwo Êmierci zaka- onych zmuszajà nas do szybkiego dzia ania; pozwala to na wykorzystanie ograniczonej liczby metod diagnostycznych w krótkim czasie. Mo liwe jest równoczesne wprowadzenie oznaczeƒ za pomocà metod klasycznych, np. izolacji wirusów wymagajàcych okresu kilku do kilkunastu dni, oraz metod szybkich, które mo emy przeprowadziç w ciàgu kilku do kilkunastu godzin. Wirusy sà zbudowane z nukleokapsydu, zawierajàcego jeden rodzaj kwasu nukleinowego (DNA albo RNA), w przypadku niektórych wirusów nukleokapsyd otoczony jest glikolipidowà os onkà. Rozmiary wirusów pozwalajà na zaobserwowanie ich obecnoêci za pomocà mikroskopu elektronowego ( nm). Wirusy sà bezwzgl dnymi paso ytami wewnàtrzkomórkowymi, które poza ywà komórkà sà strukturami inertnymi. W zaka onej komórce wykorzystujà metabolizm w celu powielenia swojego materia u genetycznego. Z tego powodu nie mo na ich izolowaç za pomocà pod o y nie zawierajàcych ywych komórek, tak e syntetycznych pod o y bakteriologicznych. Komórki, w których mogà replikowaç wirusy, mogà pochodziç z ró nych organizmów, jednak ka dy wirus wymaga okreêlonego rodzaju komórek ze wzgl du na z o one procesy wzajemnego oddzia ywania mi dzy wirusem a zaka onà komórkà. W laboratoriach pos ugujemy si komórkowymi liniami ciàg ymi (cz sto sà to linie wyprowadzone ze zmian nowotworowych), liniami pierwotnymi o ograniczonej liczbie pasa y. W niektórych przypadkach zmuszeni jesteêmy pos ugiwaç si zwierz tami (oseski mysie, Êwinki morskie i inne), a tak e zal onymi jajami. Izolacja i namna anie wirusów wymagajà odpowiedniego wyposa enia laboratoriów, badania takie sà kosztowne oraz czasoch onne. Pozytywny wynik badaƒ i potwierdzenie izolacji wirusa umo liwia potwierdzenie rozpoznania, jednak ujemny wynik badaƒ i brak izolacji mogà byç spowodowane b dami zwiàzanymi z pobraniem, transportem i zastosowanymi metodami diagnostycznymi. 78

3 Tabela 3. Cechy ró niàce mikroorganizmy i wirusy Mikopla- Chlamy- Cecha Bakterie Riketsje Wirusy Wiroidy Priony zmy die Widoczne w mikroskopie + +/ + +/? Êwietlnym Wzrost w martwych + + pod o ach Namna anie przez podzia Kwas nukleinowy DNA DNA DNA DNA DNA RNA /? i RNA i RNA i RNA i RNA albo RNA Zakaêny kwas + + /? nukleinowy Rybosomy Metabolizm Wra liwoêç na antybiotyki

4 Bardzo du y wp yw na wynik oznaczeƒ mo e mieç czas i rodzaj pobranego materia u oraz sposób jego pobrania (np. zanieczyszczenia DNA podczas pobierania kilku próbek). Istotny jest tak e sposób przechowywania i temperatura transportu materia u. W warunkach laboratoryjnych nale y zwróciç uwag na dwa aspekty: bezpieczeƒstwo personelu laboratorium oraz zabezpieczenie próbki przed zanieczyszczeniami, powodujàcymi fa szywie dodatnie wyniki oznaczeƒ. Bezpieczeƒstwo pracowników laboratorium obejmuje, jeêli to mo liwe, szczepienia profilaktyczne personelu, stosowanie opracowanych wczeêniej procedur post powania oraz prac z okre- Êlonymi wirusami w laboratorium o odpowiednim stopniu bezpieczeƒstwa biologicznego. Praktycznie wirusowe czynniki, które mogà byç zastosowane jako broƒ biologiczna, powinny byç badane w laboratorium o 3 i 4 stopniu bezpieczeƒstwa biologicznego (BSL-3 i BSL-4). Tabela 4. Metody diagnostyki zaka eƒ wirusowych na podstawie w aêciwoêci biologicznych wirusa [I], bezpoêrednie wykrycie wirusa lub jego podjednostek [M], jego bia ek [B] lub materia u genetycznego [G] oraz odpowiedzi immunologicznej [S] Grupa Metoda Omówienie metody Wady i ograniczenia I Izolacja ZdolnoÊç wywo ywania Zró nicowanie wymazmian w zaka onych gaƒ wirusów pod wzgl organizmach lub hodo- dem zaka ania i patowlach komórkowych; gennoêci dla okreêlopotwierdzenie obecnoêci nych gospodarzy, jaj aktywnego patogenu czy linii komórkowych; stanowi podstawowe wyst powanie wielu êród o materia u do im- wirusów zaka ajàcych munologicznej diagno- dane komórki lub wystyki i immunoprofilak- wo ujacych podobne tyki objawy konieczna dalsza identyfikacja M1 Mikroskopia BezpoÊrednie zaobser- Konieczna znaczna elektronowa wowanie wirusa w ba- liczba czàstek wirusów danym materiale; w po- w badanym materiale; àczeniu z metodami bez badaƒ immunoloimmunologicznymi mo- gicznych niemo liwe liwoêç bezpoêredniej okreêlenie patogenu swoistej identyfikacji bli ej ni do rodziny 80

5 cd. tab. 4. Grupa Metoda Omówienie metody Wady i ograniczenia M2 Bierna Zlepienie przez wirusa Konieczna znaczna liczaglutynacja lub jego antygeny op a- ba czàstek wirusów szczonych swoistymi w badanym materiale; przeciwcia ami krwinek nieswoiste reakcje wylub lateksu szybkie wo ywane przez subbezpoêrednie wykrycie stancje aglutynujàce patogenu krwinki B1 Immunofluores- Wiàzanie znakowanych Przy przeciwcia ach pocencja przeciwcia, szybkie wy- liklonalnych mo liwe krycie i ró nicowanie reakcje nieswoiste; przy antygenów w komór- monoklonalnych mogà kach w badanym mate- wykrywaç tylko wybrane riale subpopulacje wirusa B2 Immunoper- Jak w B1, zamiast mi- Jak w B1, ale znacznie oksydaza kroskopu fluorescencyj- trudniejsze ró nicowanego zwyk y nie wybarwienia struktur morfologicznych B3 Wykrywanie Wykrycie reaktywnoêci Brak mo liwoêci bezpoenzymów wirusa odwrotnej transkrypta- Êredniej dok adnej zy jako potwierdzenie identyfikacji wirusa obecnoêci posiadajàcych jà retrowirusów B4 Immunoenzyma- Zwiàzanie antygenu Jak w B1 przy równotyczny ELISA# przez przeciwcia a i wy- czesnym braku mo likrycie innymi swoistymi woêci zró nicowania na przeciwcia ami; du a podstawie morfologii czu oêç, wykrywa wolne komórek pozakomórkowe antygeny G1 Elektroforeza Rozdzia segmentów/ Wymaga du ej koncengenomu /fragmentów genomu; tracji oznaczanych elepodstawowa przy seg- mentów, wra liwa na mentowanych genomach zanieczyszczenia nuklewirusa, pomocnicza azami przy innych G2 Hybrydyzacja Wykrywanie sekwencji Wymaga dostosowania DNA lub RNA nukleotydów przez temperatury do zmienzwiàzanie komplemen- noêci populacji patogetarnego znakowanego nu, wra liwa na nuklefragmentu kwasu nu- azy kleinowego 81

6 cd. tab. 4. Grupa Metoda Omówienie metody Wady i ograniczenia G3 Amplifikacje Wielokrotne powielenie Dotychczasowe techniki genomu okreêlonego obszaru nie uwzgl dniajà zmiengenomu (PCR i inne); noêci populacyjnej wibardzo wysoka teore- rusów i podobieƒstw tyczna czu oêç i swo- ewolucyjnych (homoloistoêç uwarunkowana gie) i funkcjonalnych sekwencjami ogranicza- (analogie) genomów; jàcymi; identyfikacja wra liwe na nukleazy produktu metodami G1 i inhibitory polimeraz lub G2 S1 OWD KonkurencyjnoÊç o do- Ma a czu oêç, brak ró pe niacz kompleksów nicowania klas immuamboceptor krwinka noglobulin, antykomi antygen przeciwcia o, plementarnoêç surowic poprawna swoistoêç S2 OZHA Blokowanie przez prze- Inhibitory, brak hemciwcia a wyst pujàcych aglutynin u wielu wina niektórych wirusach rusów, niezale noêç od receptorów dla krwinek; klas immunoglobulin zwiàzek z przeciwcia- ami zoboj tniajàcymi wirusa i chroniàcymi przed zaka eniem S3 Neutralizacja Eliminacja zakaênoêci D ugotrwa oêç wykonaprzez zwiàzane z wiru- nia, dla cz Êci wirusów sem przeciwcia a; ró ni- trudnoêci z doborem cowanie ÊciÊle spokrew- pod o a (zwierz ta, nionych antygenowo hodowle komórkowe), wirusów; rzeczywista w którym namna a si ocena uodpornienia wirus S4 Bierna Aglutynacja przez Czu oêç metody; przy aglutynacja przeciwcia a op aszczo- biernej hemaglutynacji nego na noêniku anty- reaktywnoêç przeciwcia genu; patrz M2 dla krwinek jako êród o fa szywie dodatnich wyników; brak ró nicowania w klasach immunoglobulin S5 Znakowanych Wiàzanie znakowanych Zró nicowana czu oêç antyimmunoglobulin w zale noêci od wyzna- (IF, ELISA, RIA, z kompleksem antygen kowania; mo liwoêç fa - FIAX) przeciwcia o; metoda szywie dodatnich wyni- 82

7 cd. tab. 4. Grupa Metoda Omówienie metody Wady i ograniczenia iloêciowa, ró nicowanie ków oznaczeƒ IgM przy odpowiedzi w klasach obecnoêci RF, problem immunoglobulin mono- i poliklonalnych przeciwcia jak w B1, przy artefaktowych antygenach mo liwe reakcje fa szywie ujemne i dodatnie S6 Znakowanego a) zwiàzanie z wyselek- a) ma o u yteczna do antygenu (jak cjonowanymi przeciw- badania IgG w surowiwy ej) cia ami (np. celisa) cach, w których swoiste albo b) w reakcji, w któ- przeciwcia a stanowià rej wykrywane prze- niewielkà cz Êç ogó u ciwcia a stanowià mo- immunoglobulin G, stek pomi dzy zwiàza- b) wymagajà potwiernym z noênikiem nie- dzenia ze wzgl du na znakowanym antyge- wp yw si y wiàzania nem a znakowanym oraz mo liwoêç wyst poantygenem b dàcym wania w badanym madetektorem teriale innych substancji wià àcych antygen S7 Western Zastosowanie metody Denaturacja epitopów jak w S5 do wykrywania przestrzennych antygeswoistoêci przeciwcia nów (najcz Êciej zwiàdla antygenów rozdzielo- zanych z odpowiedzià nych elektroforetycznie chroniàcà przed zakai zwiàzanych z noênikiem eniem) Tabela 5. Zastosowanie przedstawionych w tabeli 4 metod do diagnostyki wybranych zaka eƒ wirusowych Zaka enia wirusowe Przyk adowe wirusy Metody (oznaczenia z tab. 4) O ostrym przebiegu wirusy grypy, RSV, B1, B4, I, G3 z krótkim okresem wyl - parainfluenzy gania (kilka dni): adenowirusy Oddechowe enterowirusy I, S3, S1, G3 rynowirusy I, G3 Jelitowe rotawirusy B4, M2, M1, G1, I adenowirusy M2, M1, I astrowirus, wirus Norwalk M1 83

8 cd. tab. 5. Zaka enia wirusowe Przyk adowe wirusy Metody (oznaczenia z tab. 4) Inne wzw. A enterowirus S5 (IgG/M), G3 O ostrym przebiegu z d u - odry, ró yczki, n.z.p. S5 (IgG/M), S6, S2, S1 szym okresem wyl gania (ok. 2 tygodni lub wi cej parwowirus B19 S5 (IgG/M), G2 bez przewlek ych zaka eƒ i latencji) Zaka enie wirusami CMV, HSV, EBV S5 (IgG/M), G3 zdolnymi do latencji HHV-6 B1, i reaktywacji lub wzw. (B, C) S5 G3 przewlek ych zaka eƒ HIV S5, (S7) *, (B1) *, G2, G3 wirusy papilloma G2 G3 enterowirusy I,S3,S1,G3 (badanie surowicy i p ynu kzm. (i inne flawiwirusy) S5 (IgG) (S7) *, S2, S1, I mózgowo-rdzeniowego) odry (ostre), odry S5 (IgG/M), I, S5 (IgG) (przewlek e SSPE) HSV,CMV S5 (IgG/M), S6, G3 wêcieklizny B1 #, S5 (IgG/M) Zaka enia p odu ró yczki, CMV, HSV S5 (IgG/M), S6, G3 parwowirus B19 S5 (IgG/M), G2 Oznaczenia zastosowane w tab. 4 i 5: Tekstem pó grubym oznaczono najcz Êciej stosowane metody o sprawdzonej wiarygodnoêci. Tekst podkreêlony w celu pe nego rozpoznania niezb dne jest badanie kilku antygenów. (S7) * metody referencyjne # badanie w prawid owej diagnostyce do badania: a) odpowiedzi immunologicznej; materia ami sà surowica i p yn mózgowo-rdzeniowy, b) do izolacji p yn mózgowo-rdzeniowy, wyjàtkowo inne materia y (np. enterowirusy ka ). (Wed ug W. Gut, M. Kaƒtoch, 1966). W ca ym procesie diagnostyczno-leczniczym wszystkie decyzje musi podejmowaç lekarz prowadzàcy, do niego te nale y interpretacja wyników, które otrzyma od wirusologa. Niezb dny jest Êcis y kontakt mi dzy klinikà a laboratorium wirusologicznym. 84