ROLNICTWO MOLEKULARNE

Transkrypt

1 ROLNICTWO MOLEKULARNE Produkcja cytokin w roślinach. Patrycja Redkiewicz Dr Anna Góra-Sochacka Prof. dr hab. Agnieszka Sirko 1

2 CYTOKINY są to małe cząsteczki (gliko)proteinowe regulujące bardzo różnorodne procesy takie jak proliferacja, różnicowanie czy ruchliwość komórek biorących udział w odpowiedzi odpornościowej oraz komórek hemopoetycznych Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94

3 PODZIAŁ CYTOKIN Interleukiny Hematopoetyny Chemokiny Interferony Nadrodzina cząsteczek TNF Inne cytokiny Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94

4 FUNKCJE CYTOKIN Ann. N.Y. Acad. Sci. 1056: (2005).

5 CYTOKINY STOSOWANE JAKO LEKI Cytokiny Interferon-α (INF-α) Interferon-β (INF-β) Interferon-γ (INF-γ) Erytropoetyna-α (EPO-α) Preparaty dostępne jako leki Intron A (Schering Plough) Roferon A (Hoffman La Roche) Betaseron (Bayer) Avonex (Biogen Idec) Actimmune (Intermune Pharma) Eprex (Cilag Jansen) Epogen (Amgen) Procrit (Ortho Biotech) Chronic hepatitis B Chronic hepatitis C Hairy cell leukemia Chronic myeloloid leukemia, Condyloma acuminate, AIDS-related Kaposi s sarcoma Relapsing multiple sclerosis Malignant osteopetrosis Chronic granulomatous disease Anemia due to chronic renal failure, HIV infected patients, chemotherapy, primary bone marrow disorders IL-2 G-CSF GM-CSF Aldesleukin (Novartis) Metastatic renal cell cancer, metastatic melanoma Neupogen Neutropenia (Hoffman La Roche) Leukine /Sargramostin (Bayer) Leukemia, Bone marrow /stem cell transplants Int. J. Mol. Sci. 2011, 12,

6 PRZEGLĄD LITERATURY ( )

7 Cytokina Materiał roślinny Elementy kasety ekspresyjnej Metoda Poziom produkcji Erytropoety na G-CSF zawiesina komórkowa Nicotiana tabacum zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa Oryza sativa GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa promotor 35S CaMV, terminator 35S CaMV promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji; terminator genu nos promotor 35S CaMV, sekwencja wzmacniająca translację z wirusa TEV, etykieta His, terminator T7 promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, terminator nos promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego α-amylazę za pomocą RNAi do poziomu 8.2% promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego cysteinową proteinazę za pomocą RNAi mikrowstrzeli wanie mikrowstrzeli wanie mikrowstrzeli wanie % TSP; 25 pg/l 105 μg/l 150 µg/l (wewnątrz kom.); 250 µg/l (wydzielane) µg/l 129 mg/l (25% wydzielanych białek) do 280 mg/l do 290 mg/l GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu; współekspresja genu kodującego syntetyczny inhibitor proteaz (spi-ii) mikrowstrzeli wanie do 250 mg/l

8 GM-CSF liście Saccharum promotor MUbi-1 z kukurydzy i SCubi-9 z trzciny cukrowej mikrowstrzeli wanie 0,02% TSP GM-CSF nasiona N. tabacum promotor gluteiny Gt1, Gt3, peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos 0,005-0,03% TSP GM-CSF nasiona O. sativa promotor gluteiny Gt1, peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos 1.3% TSP GM-CSF nasiona O. sativa GM-CSF liście Nicotiana benthamiana Promotor gluteiny Gt13a (specyficzny dla endospermy nasion), peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos, optymalizacja kodonów wektor pochodna PVX: promotor 35S CaMV, etykieta His wektor wirusowy PVX 0,5-14 μg/ nasiono 0,2-2% TSP IL-2; IL-4 zawiesina komórkowa N. tabacum promotor 35S CaMV, terminator T7 Transformacja 0,09 mg/l 0,45 mg/l

9 IL-10; IL-4 IL-18 IL-2 IL-10 liście N. tabacum liście N. tabacum bulwy S. tuberosum liście N. tabacum IL-4 liście N. tabacum, bulwy S. tuberosum TNF-α Solanum tuberosum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, t-cupwzmacniacz translacji, ELP, KDEL, terminator nos promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji, terminator nos promotor patatyny; terminator nos 1. promotor 35S CaMV, etykieta His, peptyd kierujący do chloroplastów oraz kaseta bez etykiety His 2. promotor 35S CaMV, etykieta His; peptyd kierujący do mitochondriów promotor 35S CaMV, sekwencja KDEL kierująca białka na szlak sekrecyjny promotor 35S CaMV, Ω wzmacniacz translancji, sekwencja SEKDEL kierująca białka na szlak sekrecyjny 0,27% TSP (IL-10); 0,086% TSP (IL-4) 0,004 0,051% TSP; 351 ng/g 115 U/mg TSP 1. 7 ng/mg TSP (bez His); 43 ng/mg TSP (z His) 2. brak akumulacji 0,1% TSP w tytoniu; 0,08% TSP w ziemniaku 15 µg/g tkanki

10 IL-12 liście N. tabacum promotor 35S CaMV, terminator 35S CaMV IL-12 IL-12 liście i owoce Lycopersicon esculentum zawiesina komórkowa N. tabacum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem, terminator 35S CaMV promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji IL-13 liście N. tabacum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji; wzmacniacz translacji z wirusa AMV, KDEL, terminator nos Kardiotrof ina-1 liście N. tabacum, chloroplastów IFN-α2b liście N. tabacum, chloroplastów 1. promotor rrn (promotor 16S RNA) i wzmacniacz translacji (5 UTR genu 10 faga T7) 2. promotor psba i wzmacniacz translacji (5 UTR psba) Kaseta ekspresyjna: 5 UTR/HIS/THR/IFNα2b sklonowana w wektorze chloroplastowym pld-ctv mikrowstrzeliw anie mikrowstrzeliw anie 40ng/g 7,3μg/g liści 4,3μg/g owoców 175μg/l 0,15% TSP 1. 0,14 mg/g 2. do 1,14 mg/g 3mg/g, 20% TSP Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94

11 ROŚLINY TRANSGENICZNE: PBJ (2008) 6, Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture Protein Expr. Purif. (2008) 61, Improvement of recombinant hgm-csf production by suppression of cysteine proteinase gene expression using RNA interference in a transgenic rice culture Plant Mol Biol (2008) 68,

12 ROŚLINY TRANSGENICZNE 1. Konstrukcja kasety ekspresyjnej (wybór promotora) 2. Wprowadzenie kasety do wektora binarnego (np.pbinplus) 3. Transformacja Agrobacterium 4. Transformacja tkanki roślinnej Figlerowicz i wsp. 2006, Biotechnologia 3,

13 Konstrukcja kasety ekspresyjnej (optymalizacja transkrypcji i translacji) Promotory konstytutywne: CaMV35S (x2) Promotory specyficzne-tkankowo: gluteiny Gt1,Gt3, patatyny Promotory indukowane: W tytoniu ekspresja po zerwaniu liści przy ich cięciu (CropTech Corp., USA (promotor MeGA TM ) Promotor genu peroksydazy z wilca ziemniaczanego, po ekspozycji na zranienie lub UV, 30x silniejszy od promotora 35S CaMV wzmacniacze translancji: z wirusa AMV, Ω, t-cup produkcja w liściach: kierowanie do ER (KDEL)

14 PBJ(2008),6, A novel platform for biologically active recombinant human interleukin-13 production Funkcje: może być stosowana w leczeniu cukrzycy I typu Roślina: N.tabacum Ekspresja: stabilna, promotor CaMV35S z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, wzmacniacz translancji z wirusa AMV,6xhistag, KDEL Poziom produkcji: 0,15%TSP

15 Analiza Western blot transgenicznych roślin Deglikozylacja

16 trawienie trypsyną, ph 8 pepsyna, ph 1.2 pankreatyna, ph 6.8

17 Badanie aktywności komórki TF-1 oczyszczona IL-13

18 Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture Protein Expr. Purif. (2008) 61, Roślina: zawiesina komórkowa O.sativa Ekspresja: stabilna, promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu; współekspresja genu kodującego syntetyczny inhibitor proteaz (spi-ii) Poziom produkcji: do 250mg/l

19 Fig. 5 Measurement of hgm-csf accumulation in suspension culture medium Fig.4 Protease activity in suspension culture medium derived from transgenic callus