(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/52 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 38/20 ( ) A61P 31/00 ( ) A61P 31/18 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Interleukina-22 (IL-22) do zapobiegania chorobom zakaźnym (30) Pierwszeństwo: US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/06 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2011/09 (73) Uprawniony z patentu: Institut de Recherche pour le Développement ( IRD), Paris, FR Immunoclin Ltd, London, GB (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANCISCO VEAS, Maugio, FR DOROTHÉE MISSE, Montpellier, FR MARIO CLERICI, Milano, IT DARIA TRABATONI, Desio, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marek Passowicz DR. ANDRZEJ AU & CO. RZECZNICY PATENTOWI P.O. Box Poznań 9 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 - 1 - EP B1 Interleukina-22 (IL-22) do zapobiegania chorobom zakaźnym [0001] Wynalazek dotyczy biomarkerów odporności na zakaŝenia u ludzi oraz ich zastosowań biologicznych, w szczególności w diagnostyce, profilaktyce i leczeniu. [0002] Dotyczy biomarkerów odporności na zakaŝenia wywoływane ogólnie czynnikami chorobotwórczymi, w szczególności infekcje wirusowe i retrowirusowe, a zwłaszcza zakaŝenie wirusem HIV. [0003] Pod koniec XX wieku pojawiło się kilka nowych chorób wirusowych, z których na pierwsze miejsce wysuwa się zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) wywołany przez ludzki wirus upośledzenia odporności (HIV). Po upływie ponad dwudziestu lat od odkrycia wirusa, epidemia HIV jest nadal znaczącym obciąŝeniem pod względem zdrowotnym, społecznym i ekonomicznym na całym świecie. W 2002 r. odnotowano ok. 3,1 mln zgonów osób zaraŝonych wirusem HIV oraz ok. 5 mln nowych przypadków zakaŝeń. PoniewaŜ aktualnie na całym świecie wirusem zakaŝonych jest ponad 40 mln osób, istnieje pilna potrzeba znalezienia nowych środków, które powstrzymałyby rozprzestrzenianie się wirusa, a takŝe przyczyniłyby się do udoskonalenia obecnie stosowanych schematów leczenia. Do tej pory wyŝszą lub niŝszą indywidualną podatność na zakaŝenie przypisywano takim czynnikom, jak repertuar genów gospodarza, wrodzoną i nabytą odpowiedź odpornościową, mutacje lub osłabienie wirusa. W ostatnim czasie poczyniono istotne postępy w zrozumieniu mechanizmu wnikania ludzkiego wirusa upośledzenia odporności do komórek docelowych. Przełomowe odkrycia takie jak zidentyfikowanie koreceptorów wirusa oraz struktury białka otoczki wirusa (Env) odpowiedzialnego za przyłączanie do receptora dostarczyły istotnych informacji na temat udziału białka Env w procesie fuzji otoczki wirusa z błoną komórkową, jak przedstawiono na Fig. 1. [0004] Z uwagi na fakt, Ŝe istnieją osoby w pewnym stopniu odporne na zakaŝenie pomimo wielokrotnej ekspozycji na działanie wirusa HIV, a u niektórych osób zakaŝonych wirusem obserwuje się bardzo spowolnioną progresję choroby, istnieje szansa na poznanie mechanizmów leŝących u podłoŝa naturalnej odporności na wirusa HIV. Co ciekawe, w obu kohortach, czyli w grupie osób eksponowanych na HIV, seronegatywnych (Exposed Seronegative, ESN) określanych takŝe jako osoby eksponowane na HIV, niezakaŝone (Exposed Uninfected, EU) oraz w grupie osób zakaŝonych o spowolnionym rozwoju zakaŝenia (Slow Progressors, SP), określanych

3 - 2 - EP B1 równieŝ jako osoby zakaŝone, u których przez długi czas nie dochodzi do rozwoju AIDS (Long Term Progressors, LTNP), obserwuje się podobną odpowiedź odpornościową, tj. wytwarzanie przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciw analogicznym celom, które mogą odgrywać rolę ochronną hamując wnikanie i/lub rozprzestrzenianie się wirusa. [0005] W pracy autorstwa Ranki (1989) opisano interesujące zjawisko: w grupie partnerów, u których pomimo utrzymywania kontaktów seksualnych z męŝczyznami HIVpozytywnymi nie stwierdzono obecności antygenu wirusa ani przeciwciał HIV, wykryto analogiczną, swoistą dla HIV odpowiedź limfocytów T wobec wirusa, natywnego białka gp 120 oraz rekombinowanych białek otoczki i rdzenia. Tę pierwotną obserwację potwierdzono takŝe w dwóch kolejnych doniesieniach, a autorzy zwrócili uwagę na moŝliwość, iŝ naraŝenie na wirusa HIV, po którym nie nastąpiła serokonwersja i zakaŝenie moŝe wiązać się z wyłącznym uaktywnieniem limfocytów pomocniczych T [2]. Badania przeprowadzone w róŝnych kohortach osób o wysokim ryzyku zakaŝenia wirusem HIV, z uwzględnieniem pracowników słuŝby zdrowia naraŝonych na zakaŝenie drogą pozajelitową oraz zdrowych noworodków matek zakaŝonych HIV wykazały u osób z powyŝszych grup obecność swoistych dla HIV limfocytów pomocniczych T, przy jednoczesnym braku przeciwciał. Obserwacje te dały początek hipotezie, według której ekspozycja na wirusa powodująca wyłączną aktywację swoistych dla HIV limfocytów T moŝe wiązać się z ochroną organizmu przed faktycznym zakaŝeniem wirusem. Dowodem istotnie wzmacniającym postawioną hipotezę jest analiza trzech zawodowych prostytutek z Nairobi (kohorta Pumwaani), w którym wykazano, Ŝe choć u większości kobiet parających się prostytucją zakaŝenie wirusem HIV następowało w ciągu pierwszego roku od rozpoczęcia działalności prostytucyjnej, u znaczącej mniejszości (oszacowanej następnie na ok. 15% badanych osób) stwierdzono wyraźną odporność na infekcję. 2) Sarah Rowland-Jones wykazała obecność swoistych dla HIV cytotoksycznych limfocytów T (CTL) u zdrowych noworodków urodzonych przez matki zakaŝone wirusem HIV. Wykrycie u noworodków obecności swoistych dla HIV limfocytów T typu CD8 produkujących IFNã było punktem zwrotnym, który ukazał, Ŝe ekspozycja na wirusa HIV, po której nie następuje serokonwersja wiąŝe się z faktycznym wystąpieniem nieproduktywnego zakaŝenia oraz Ŝe za pobudzenie swoistej odporności odpowiedzialna jest obecność Ŝywych, zdolnych do replikacji wirusów. Zasadniczo rzecz biorąc, jedynie faktyczne zakaŝenie wirusem mogłoby skutkować prezentacją antygenów wirusowych przy udziale cząsteczek HLA klasy I oraz pobudzeniem odpowiedzi odpornościowej związanej z oddziaływaniem limfocytów CD8 (znacznie później funkcję ochronną odporności mediowanej komórkowo w tym aspekcie potwierdziła obserwacja,

4 - 3 - EP B1 iŝ późna serokonwersja występująca u zawodowych prostytutek kenijskich odpornych na HIV, które przerywają działalność prostytucyjną na określony okres wiąŝe się z osłabieniem odpowiedzi limfocytów CD8+ swoistej wobec HIV ze względu na obniŝoną ekspozycję antygenową. 3) Eksperymenty in vivo prowadzone na makakach, do których organizmów wprowadzano subinfekcyjne dawki wirusa SIV oraz u których wykryto obecność swoistych limfocytów pomocniczych T potwierdziły istnienie ochrony w przypadku kolejnych prób prowokacyjnych polegających na podawaniu dawek infekcyjnych tego samego wirusa (wyników tych jednak nie potwierdziły w sposób jednoznaczny badania prowadzone przez innych badaczy). [0006] W ten sposób narodziła się dziedzina badań nad korelatami immunologicznymi odporności na zakaŝenie wirusem HIV. Kolejne waŝne doniesienia wykazały, iŝ u osób naraŝonych na wirusa HIV, u których nie nastąpiło zakaŝenie: 1) mogą występować określone uwarunkowania genetyczne, w tym delecja w pozycji 32 genu kodującego receptor CCR5; 2) występuje nasilone wydzielanie czynników rozpuszczalnych, w tym komórkowych czynników antywirusowych (CAF), beta-chemokin oraz alfa-defensyn; 3) w wydzielinie szyjkowo-pochwowej oraz ejakulacie wykryć moŝna wydzielnicze immunoglobuliny IgA swoiste wobec HIV, a takŝe limfocyty pomocnicze T i limfocyty cytotoksycznye CTL [19] oraz 4) moŝna zaobserwować szczególnie nasiloną aktywność komórek NK [2]. Tym samym po upływie 15 lat od pierwszego doniesienia o wykryciu u osób seronegatywnych limfocytów pomocniczych T swoistych dla HIV, odnotowywane przypadki odporności na zakaŝenie wirusem HIV moŝna najogólniej skorelować z uaktywnieniem odporności ogólnoustrojowej i pobudzeniem mechanizmów odpornościowych w komórkach błon śluzowych oraz aktywnością immunoglobulin IgA w błonach śluzowych, przy moŝliwym współudziale korzystnych czynników genetycznych i naturalnych uwarunkowań odpornościowych.

5 - 4 - EP B1 Tabela 1. Mechanizmy wymieniane jako związane z odpornością na zakaŝenie wirusem HIV Mechanizmy nabyte Mechanizmy genetyczne Odporność wrodzona Swoiste wobec HIV limfocyty pomocnicze T Swoiste wobec HIV limfocyty cytotoksyczne (CTL) Swoiste wobec HIV immunoglobuliny IgA w błonach śluzowych Przeciwciała anty-cd4 Przeciwciała anty-ccr5 Delecja w koreceptorach HIV-1 Określone allele antygenów HLA PodwyŜszona aktywność komórek NK PodwyŜszone wydzielanie beta-chemokin PodwyŜszone wydzielanie CAF PodwyŜszone stęŝenie alfadefensyn [0007] Poznanie mechanizmów naturalnej odporności na zakaŝenie wirusem HIV moŝe mieć istotne implikacje dla identyfikacji nowych strategii przeciwwirusowych, a zwłaszcza dla rozwoju innowacyjnych metod diagnostycznych i terapeutycznych oraz opracowania szczepionki. [0008] Wynalazcy porównali badania dotyczące profili białkowych (proteomów) oraz ekspresji genomowej (transkryptomów) u osób eksponowanych na HIV, lecz niezakaŝonych (EU); osób eksponowanych na HIV, zakaŝonych (HIV+) oraz zdrowych dawców (HC) w celu wykrycia u osób z grupy EU biomarkerów, które mogłyby tłumaczyć mechanizmy obrony wobec zakaŝenia wirusem HIV. [0009] Zidentyfikowali kluczową cytokinę, która jak się wydaje jest odpowiedzialna za indukcję białek uczestniczących w powstawaniu odporności na wirusy. [0010] Stwierdzili ponadto występowanie w badanych kohortach polimorfizmu innej cytokiny, wykazującej szczególne prawidłowości w obrębie kohorty EU. TakŜe inne izoformy wydają się uczestniczyć w procesach warunkujących odporność na wirusa HIV na skutek wpływu wywieranego na receptory FPR lub FPRLI, a następnie fosforylacji koreceptorów CCR5 lub CXCR4 wirusa HIV. Kombinację tych cytokin uznano następnie za czynnik pośrednio uczestniczący w blokowaniu zakaŝenia wirusowego. Wydaje się, Ŝe zarówno indywidualnie, jak i łącznie biorą one udział w mechanizmach odporności wobec HIV.

6 - 5 - EP B1 [0011] Wynalazek dotyczy wykorzystywania interleukiny-22 (IL-22) w profilaktyce chorób zakaźnych poprzez stymulowanie wrodzonej odpowiedzi odpornościowej. [0012] Białka wrodzonej odpowiedzi odpornościowej (w tym Il-22 szlaku Jak/STAT, SOCS3, beta-defensyny (2 i 3), białko ostrej fazy apolipoproteina surowiczy amyloid Ac lub A-SAA bądź ich fragmenty, a takŝe cytokina IL-8 oraz jej izoformy) mają ogromny potencjał pod względem zastosowań biologicznych, poniewaŝ wykazują właściwości biomarkerów odporności na zakaŝenie wirusem HIV. W szczególności mają one ogromne znaczenie z punktu widzenia diagnostyki, terapii i profilaktyki. [0013] We wspomnianym wyŝej zastosowaniu skuteczna ilość IL-22 połączona jest z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. [0014] Kompozycje farmaceutyczne stanowiące przedmiot wynalazku są korzystnie opracowane pod kątem podawania pacjentom drogą doustną, domięśniową, doŝylną lub na śluzówki. [0015] W celu stosowania doustnego prezentowane są w postaci tabletek, pigułek, kapsułek, kropli, plastrów miejscowych lub aerozolu. [0016] W celu stosowania w drodze iniekcji kompozycje farmaceutyczne opracowane są w postaci roztworu przeznaczonego do iniekcji doŝylnych, podskórnych lub domięśniowych, z wykorzystaniem sterylnego lub sterylizowalnego roztworu, zawiesiny lub emulsji. [0017] W celu stosowania naśluzówkowego, kompozycje farmaceutyczne dostępne są w postaci Ŝelów. [0018] Dawkowanie moŝe być łatwo dostosowywane do stanu pacjenta przez wykwalifikowaną osobę. [0019] W odniesieniu do innego aspektu, wynalazek dotyczy metody pobudzania wrodzonej odporności gospodarza na zakaŝenia o podłoŝu wirusowym, obejmującej wykorzystywanie IL-22 jako cytokiny inicjującej, która wspomaga mechanizm wrodzonej odporności na zakaŝenia. [0020] Pozostałe cechy i zalety wynalazku omówione będą w poniŝszych przykładach

7 - 6 - EP B1 oraz w odniesieniu do Fig. 1-10, przedstawiających odpowiednio: Fig. 1: Poszczególne etapy przyłączania się otoczki wirusa do receptorów komórkowych, Fig. 2: Profil białkowy SELDI-TOF osób z róŝnych kohort, Fig. 3: Hamujący wpływ na zakaŝenie wirusem HIV-1 w infekcji przebiegającej kaskadowo w grupie EU, Fig. 4: Deplecja białka o wielkości ok. 8,6 kda przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych anty-a-saa, Fig. 5 i 6: Porównawcza analiza RT-PCR dla IL-8 (Fig. 5) i IL-22 (Fig. 6) u osób z róŝnych kohort, Fig. 7: Potwierdzenie metodą Western blot analizy SAGE osób z róŝnych kohort, Fig. 8: Indukcja fosforylacji CCR5, koreceptora HIV-1, wywołana przez związanie białka ostrej fazy SAA z receptorem FPR, Fig. 9: Zakaźność wirusa HIV-1 R5 w stosunku do niedojrzałych komórek dendrytycznych. Fig. 10: Profil SELDI-TOF preparatu SAA przedstawiający fragment wielkości ~8,6 kda. Materiały i metody Rekrutacja osób eksponowanych, lecz niezakaŝonych (EU) [0021] Do badania włączono osoby eksponowane na wirusa HIV, które nie uległy zakaŝeniu (Exposed, Uninfected; EU). W kaŝdym przypadku osoba eksponowana na HIV, lecz seronegatywna (ESN) utrzymywała kontakty seksualne z osobą zakaŝoną wirusem; u kaŝdej pary stwierdzono w wywiadzie długi okres aktywności seksualnej z penetracją, bez uŝycia prezerwatywy (przy braku innych znanych czynników ryzyka). W przypadku osób z grupy EU jako kryterium włączenia do analizy przyjęto odbycie na przestrzeni ostatnich 4 lat licznych stosunków seksualnych bez zabezpieczenia, w tym co najmniej czterech stosunków płciowych wysokiego ryzyka w okresie 4 miesięcy bezpośrednio poprzedzających badanie. U osób z grupy EU wielokrotnie potwierdzano seronegatywność w kierunku HIV metodą posiewu oraz oznaczając stęŝenie RNA wirusa. Do badania włączono równieŝ pacjentów zakaŝonych HIV oraz grupę kontrolną złoŝoną z osób zdrowych (HC). Pacjentów zakaŝonych wirusem oraz osoby zdrowe (HC) dobrano pod względem wieku i płci do osób eksponowanych, lecz niezakaŝonych (EU). Wszyscy uczestnicy z grupy EU, HIV+ i HC podlegali dynamicznej obserwacji przez okres co najmniej 4 lat (przed rozpoczęciem badania) w Klinice Chorób Zakaźnych

8 - 7 - EP B1 Szpitala Santa Maria Annunziata we Florencji. Dzięki temu moŝna było wyeliminować z badania osoby eksponowane, lecz seronegatywne (ESN) oraz osoby zdrowe, u których we wspomnianym wyŝej okresie wystąpiły choroby przenoszone drogą płciową lub inne stany patologiczne. Uczestników z grupy EU scharakteryzowano na podstawie obecności alleli CCR5-32. U jednej osoby stwierdzono delecję heterozygotyczną. Wszyscy uczestnicy z grupy EU i HIV oraz osoby niezakaŝone z grupy niskiego ryzyka zakaŝenia wyraziły zgodę na pobranie od nich komórek jednojądrowych krwi obwodowej. Komórki [0022] Przeprowadzono porównawcze badania proteomiczne i transkryptomiczne limfocytów T pobranych od osób EU i HIV+ z par niezgodnych, tj. tworzonych przez osobę zakaŝoną i niezakaŝoną, utrzymujących częste kontakty seksualne bez zabezpieczenia lub praktykujących inwazyjne metody przyjmowania narkotyków z wymianą strzykawek. Jako grupę kontrolną przebadano limfocyty pobrane od osób zdrowych (HC). Komórki jednojądrowe krwi obwodowej (PBMC) uzyskane od uczestników z 3 kohort: osób zdrowych (HC), EU i HIV+ wyizolowano na gradiencie Fikolu (Ficoll-Hypaque), a następnie hodowano przez krótki okres (6 dni) (Yssel, H. and Spits, H, w: Current Protocols in Immunology, rozdział 7.19). Limfocyty T (CD4+ i CD8+) aktywowano CD3/CD28 i hodowano na podłoŝu RPMI w obecności 10% FCS. W skrócie, do aktywacji kompleksu CD3-TCR uŝyto 10 µg/ml przeciwciał monoklonalnych (MAb) anty-cd3, SPV-T3b, pokrywając nimi płytki 24-studzienkowe na 4 godziny w temp. 37 C. W następnej kolejności w pokrytych przeciwciałami studzienkach umieszczono 106 komórek w obecności poŝywki hodowlanej (poŝywka Yssel, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zawierającej 1% ludzkiej surowicy AB+ oraz 1 µg/ml przeciwciał MAb anty-cd28 klon L293. Wykonano trzy cykle aktywacji limfocytów T, w odpowiednio 2, 6 i 18 godz. Zebrano pulę aktywowanych limfocytów pochodzących od 5 osób z kaŝdej kohorty (przy równowaŝnej liczbie komórek i ilości całkowitego RNA, Tabela 2) w celu analizy ekspresji genów w limfocytach T. Badanie przeprowadzono metodą seryjnej analizy ekspresji genów (SAGE, Velculescu 1995). W następnej kolejności całkowite RNA poszczególnych osób z puli zostało zamroŝone do późniejszego wykorzystania przy indywidualnej walidacji wyników uzyskanych metodą SAGE. Komórki te wykorzystano równieŝ do analiz metodami Power i Western blot (zob. poniŝej). Białka rozpuszczalne obecne w osoczu badanych osób (n=25, Tabela 2) z 3 kohort poddano analizie metodą SELDI-TOF Ciphergen. [0023] Komórki dendrytyczne uzyskano z monocytów zdrowych dawców. W skrócie, koŝuszek leukocytarny ( buffy coat ) poddano obróbce w celu uzyskania

9 - 8 - EP B1 wysokooczyszczonych monocytów, które następnie hodowano na podłoŝu DMEM wzbogaconym 10% FCS w obecności 10 ng/ml IL-4 oraz 150 ng GM-CSF (Becton i Dickinson) przez 7 dni, aby wyprowadzić niedojrzałe komórki dendrytyczne (idc) dobrze scharakteryzowane przy uŝyciu odpowiednich przeciwciał monoklonalnych (anty-dc sign, anty-cd1a, anty-cd83 i anty-cd86), z potwierdzoną obecnością receptora FPRL1 (naleŝącego do rodziny receptorów dla peptydu formylowego (FPR)). Komórki przechowywano w temp. 37 C, w wilgotnym otoczeniu o 5% zawartości CO 2. Przeciwciała i odczynniki [0024] Rekombinowaną ludzką interleukinę IL-22, przeciwciała poliklonalne anty-ccr5 oraz przeciwciała poliklonalne przeciw ludzkiej IL-22 zakupiono w R&D Systems (Oxon, Wielka Brytania). Surowiczy amyloid A (A-SAA) oraz białka IL-8 zakupiono w Peprotech (Rocky Hill, NJ), a MIP-1β w Françoise Baleux (Instytut Pasteura, ParyŜ). Przeciwciała monoklonalne anty-il-8 zakupiono w Bender; przeciwciała monoklonalne anty-cxcr4, anty-saa1 i 2 w Biosource, a przeciwciała monoklonalne anty-saa w Calbiochem. Przeciwciała poliklonalne anty-active Stat-1, monoklonalne anty-stat1, poliklonalne antyactive Stat-3, poliklonalne anty-stat-3, poliklonalne anty-active Stat-5, monoklonalne anty-stat-5 w Becton and Dickinson (Palo Alto, CA). Przeciwciała poliklonalne anty- SOCS 3 zakupiono w laboratoriach Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Analiza osocza metodą Protein-Chip SELDI-TOF [0025] Przed rozpoczęciem analizy próbki osocza odwirowano z prędkością obr/min. przez 15 minut. Pelet odrzucono, a supernatant zlano i rozcieńczono (1:10) przy uŝyciu zoptymalizowanego buforu wiąŝącego (BB: NaCl 0,250 M Hepes 50 mm, o ph 7,5). Rozcieńczone próbki osocza naniesiono w ciągu 1 godziny na uprzednio nasycone silnym wymieniaczem anionowym (SAX2) chipy białkowe (Protein-chips ) poprzez dwie 5-minutowe kąpiele w buforze wiąŝącym (BB). Białka niezwiązane wypłukano sukcesywnie w 3 kąpielach po 5 min. w buforze płuczącym (WB: NaCl 1M, Hepes 50 mm, o ph 7,5), po czym wykonano ostatnie płukanie przy uŝyciu 5 µl czystej bidestylowanej wody. Białka wychwycone przez chipy wysuszono na powietrzu w temperaturze pokojowej, a następnie pokryto matrycą (kwas 3,5-dimetoksy-4- hydroksycynamonowy (sinapinowy, SPA) w 99,9% acetonitrylu i 0,1% kwasu trójfluorooctowego) w celu absorpcji promieniowania laserowego. Próbki spreparowane matrycą wysuszono w temp. pokojowej. Próbki zostały następnie poddane średnio 100 uderzeniom laserowym w czasie rzeczywistym w celu desorpcji wychwyconych białek

10 - 9 - EP B1 przy natęŝeniu od do uderzeń (jednostki arbitralne) i aby wygenerować spektrum białkowe (proteogram). Zjonizowane i zdesorbowane białka poddane zostały detekcji, a ich masy cząsteczkowe przedstawione na pikach w proteogramach oznaczono przy uŝyciu analizatora czasu przelotu (TOF) oraz oprogramowania Protein- Chip Biology System II software (PBS II; Ciphergen) i Ciphergen Peaks. Oznaczono stosunek masy do ładunku (m/z) kaŝdego wychwyconego na powierzchni chipów białka według zewnętrznie skalibrowanych wzorców: ludzkiej angiotensyny I (1,2965 kilodaltonów, kda), ludzkiego ACTH (2,9335 kda), ludzkiej â-endorfiny (3,4650 kda), insuliny bydlęcej (5,7336 kda) i ubikwityny bydlęcej (8,5648 kda). Deplecja białka o wielkości ~8,6 kda z osocza osób z grupy EU [0026] Do 25 µl kulek magnetycznych (Dynal) przepłukanych trzykrotnie przy uŝyciu I ml PBS dodano 25 µg przeciwciał monoklonalnych anty-a-saa (SAA-1 i SAA-2) (produkcji Clinisciences) o stęŝeniu 100 µg/ml, a następnie całość inkubowano przez 18 godzin w temp. 4 C na wytrząsarce orbitalnej. Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami monoklonalnymi anty-a-saa przepłukano trzykrotnie PBS o objętości 1 ml. Dodano 500 µl osocza pobranego od osób z grupy EU, a następnie inkubowano przez 3 godziny w temp. 37 C, wytrząsając. Supernatant osocza poddano ponownej analizie przy zastosowaniu odpowiednich chipów białkowych (Ciphergen). Porcję 5 µl osocza pobranego od osób z grupy EU, wstępnie inkubowanego z przeciwciałami monoklonalnymi anty-a-saa 1 i 2 lub nie, zaaplikowano i poddano analizie jak wyŝej, metodą SELDI-Tof (Ciphergen ). Hamowanie zakaŝenia wirusem HIV-1 przez rekombinowane białko A-SAA [0027] Przed zakaŝeniem HIV-1 niedojrzałe komórki dendrytyczne (idc) inkubowano przez 1 godzinę w ustalonych stęŝeniach z ludzką apolipoproteiną ostrej fazy surowiczym amyloidem A (SSA produkcji Peprotech ), który jest agonistą receptora FPRL1. Następnie komórki infekowano HIV-1 ADA lub HXB2 przy wielokrotności zakaŝenia (MOI) rzędu 0,1 przez 2 godziny. Komórki dokładnie przepłukano i inkubowano w kompletnej poŝywce. Poziom antygenów p24 HIV-1 oznaczono metodą ELISA (Beckman-Coulter, Francja) po upływie 4 dni od zakaŝenia.

11 EP B1 Analiza SAGE [0028] Analizę seryjnej analizy ekspresji genów (SAGE) przeprowadzono zasadniczo według protokołu opracowanego przez Velculescu, dostępnego na stronie internetowej: ze zmianami Powella i Kenzelmanna. Analiza Power blot [0029] Analizę białek przeprowadzono metodą immunoblot według procedury dostępnej na stronie internetowej W skrócie, stymulowane CD3/CD28 limfocyty T pochodzące od osób z 3 badanych kohort zostały zlizowane w buforze lizującym (Tris 10 mm, ph 7,4; ortowanadan Na+ I mm; SDS 1%), poddane działaniu ultradźwięków, a następnie sklarowane przez odwirowanie. Uzyskano migrację białek w gradiencie stęŝenia Ŝelów poliakrylamidowych z dodatkiem SDS 5-15% w celu wykrycia szerokiego spektrum białek w pojedynczym Ŝelu. Próbkę 400 µg białka naniesiono w długą studzienkę przez całą szerokość warstwy Ŝelu. Odpowiada to elektroforezie ok. 15 µg białka na ścieŝkę na standardowej 25-studzienkowej płytce z Ŝelem. śel przeniesiono następnie na membranę Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) i pozostawiono na noc. Po przeniesieniu, membrany zablokowano na 1 godzinę poprzez zanurzenie w 5% roztworze mleka. Następnie membranę umieszczono w aparacie do analizy Western blot, który umoŝliwia izolację 45 kanałów na całej szerokości membrany. Na poszczególnych kanałach wprowadzano róŝne złoŝone kombinacje przeciwciał i pozostawiono do hybrydyzacji na 1 godzinę. Po wybarwieniu, membrany przepłukano i przeprowadzono 30-minutową hybrydyzację przy zastosowaniu drugorzędowych przeciwciał kozich antymysich sprzęŝonych z peroksydazą chrzanową (HRP). UŜyto wyłącznie mysich przeciwciał monoklonalnych. Membrany przepłukano, a następnie wywołano przy uŝyciu odczynnika SuperSignal West Pico (Pierce, Santa Clara, CA). Analiza metodą RT-PCR [0030] Całkowite RNA wyizolowane z aktywowanych limfocytów T przepisano metodą odwrotnej transkrypcji na cdna. Do odwrotnej transkrypcji kaŝdej z próbek całkowitego RNA, wykonywanej w temp. 42 C przez 50 minut, zasto sowano następujące odczynniki: 1 µl g całkowitego RNA i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy Superscript II (RT, Gibco-BRL); dostępny bufor do odwrotnej transkrypcji; 100 mmol/l ditiotreitolu (DTT), 40 jednostek inhibitora RNaz (Rnasin) (Promega, Madison, WI, USA); 1,25 mmol/l kaŝdego deoksynukleotydu (oraz 500 ng starterów oligo dt. Reakcję łańcuchową polimerazy

12 EP B1 (PCR) przeprowadzono w następujący sposób: 2 µl cdna; 1,25 mmo/l kaŝdego dntp; 2,5 jednostki polimerazy Taq (Promega); 2,5 mmol/l MgCl2, 2,5 µl buforu 10X oraz 20 pmol kaŝdej swoistej pary starterów w łącznej objętości 25 µl. Zastosowano następujące swoiste startery: IL-22: SEKW. NR 1 sens 5 -TGACAAGTCCAACTTCCAGCAG-3, SEKW. NR 2 antysens 5 -TCTGGATATGCAGGTCAT-CACC-3 ; IL-8: SEKW. NR 3 sens 5 -AACTTCTCCACAACCCTCTG-3, SEKW. NR 4 antysens 5 -TTGGCAGCCTTC- CTGATT-3 ; GAPDH: SEKW. NR 5 sens 5 - CCA-CCC-ATG-GCA-AAT-TCC-ATGGCA- 3 i SEKW. NR 6 antysens 5 -TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3. Po inkubacji wstępnej (94 C, 5 min), kaŝdą próbkę PCR poddano 29 cyklom amplifikacji obejmującym: denaturację (94 C, I min), przyłączenie starterów (56 C, I min), wydłuŝanie starterów (72 C, 1 min) i końcowe wydłuŝanie (72 C, 10 min). Analiza metodą Western blot [0031] Milion limfocytów T aktywowanych CD3/CD28 (jak wyŝej) uzyskanych od osób z poszczególnych kohort (HC, EU i HIV+) zlizowano w buforze 1% NP40. Dla kaŝdej grupy jednakowe ilości białka zostały poddane elektroforezie w warunkach redukcyjnych, a następnie przeniesione elektroforetycznie na membrany nitrocelulozowe. Membrany inkubowano przez 30 min w buforze TBS (50 mmol/l NaCI, 20 mmol/l Tris HCl, o ph 7,5) z dodatkiem 5% BSA i 0,1% Tween 20, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Białka zwizualizowano przy wykorzystaniu systemu ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Membrany przepłukano TBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, a następnie inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi kozimi antykróliczymi lub antymysimi sprzęŝonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). W celu przeprowadzenia kolejnej analizy dla innego przeciwciała, filtry oczyszczono, jak opisano wyŝej [10]. Ocena fosforylacji koreceptora HIV-1 [0032] Niedojrzałe komórki dendrytyczne poddano stymulacji MIP-1β lub białkiem ostrej fazy A-SAA (Peprotech ) w określonych (na Fig. 7) stęŝeniach przez wskazane okresy, w temp. 37 C. Po 20 minutowej inkubacji na lodzie komórki poddano lizie, co jakiś czas mieszając, w buforze lizującym (1% Triton X-100, 20 mm Tris HCl o ph 8,0, 137 mm NaCl, 15% glicerol, 5 mm EDTA) zawierającym inhibitory fosfatazy (1 mm fluorku fenylosulfonylowego, 5 µg/ml aprotyniny, 5 µg/ml leupeptyny, 1 mm ortowanadanu sodu, 1 mm EGTA). Lizaty komórkowe wstępnie oczyszczono przy uŝyciu

13 EP B1 30 µl przepłukanych kulek sefarozowych z białkiem A (15 µl koncentratu kulek) w temp. 4 C przez 1 godz. Następnie do objętości 200 µmg lizatów komórkowych dodano 1 µg poliklonalnych przeciwciał anty-fosfoserynowych (BD). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez noc w temp. 4 C. Kompleks immunolo giczny wychwycono, dodając 50 µl przepłukanych kulek sefarozowych z białkiem A (25 µl koncentratu kulek). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez kolejne 2 godziny w temp. 4 C. Ku lki odwirowano (przez 10 sek. przy prędkości obr./min.) i po zlaniu supernatantu trzykrotnie przepłukano lodowatym buforem IX IP, po czym ponownie zawieszono w 30 µl buforu Laemmliego do prób 2X stęŝonego i gotowano przez 5 min. w celu elucji kompleksu immunologicznego. Po elektroforezie w gotowym do uŝycia 10% Ŝelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS (SDS-PAGE, Invitrogen), białka przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Wizualizację CCR5 wykonano przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych anty-ccr5 (R&D Systems) i systemu ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Ludzka hemokina, technologia Searchlight [0033] Cztery róŝne próbki osocza z kaŝdej badanej kohorty poddano analizie zgodnie z instrukcjami producenta zestawów do oznaczania chemokin Searchlight (Pierce Endogen, Perbio, Boston), aby oznaczyć stęŝenie 8 chemokin w osoczu. Wyniki [0034] Pomimo wielokrotnej ekspozycji na ludzkiego wirusa upośledzenia odporności typu I (HIV-1) drogą płciową lub ogólnoustrojową, niektóre osoby pozostają niezakaŝone. W celu zbadania mechanizmów komórkowych leŝących u podłoŝa odporności na zakaŝenie wirusem HIV-1, wynalazcy przeprowadzili badanie porównawcze limfocytów T krwi obwodowej aktywowanych CD3/CD28 (w celu wzmocnienia sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów) oraz osocza (w celu zbadania rozpuszczalnych białek) z następujących kohort: osób eksponowanych na wirusa HIV-1, lecz niezaraŝonych (EU), ich partnerów zakaŝonych HIV-1 oraz zdrowej grupy kontrolnej (NC) (Tabela 2).

14 EP B1 Lp. Kategori Partner (HIV+) kaŝdej osoby z ObciąŜenie CD4 a grupy EU wirusowe EU HIV+ 1 EU1 HIV EU2 HIV+ 21 < EU3 HIV EU4 HIV EU5 HIV EU6 HIV+ 18 < EU7 HIV EU8 HIV EU9 HIV EU10 HIV EU11 HIV+ 9 < EU12 HIV+ 29 < EU13 HIV+ 16 < EU14 HIV+ 19 < EU15 HIV+ 13 < EU16 HIV+ 30 < EU17 HIV+ 31 > EU18 HIV EU19 HIV+ 33 < EU20 HIV EU21 HIV HC 1 HC1 HIVneg 2 HC2 HIVneg 3 HC3 HIVneg 4 HC4 HIVneg 5 HC5 HIVneg 6 HC6 HIVneg 7 HC7 HIVneg 8 HC8 HIVneg

15 EP B1 9 HC9 HIVneg 10 HC10 HIVneg 11 HC11 HIVneg 12 HC12 HIVneg 13 HC13 HIVneg 14 HC14 HIVneg 15 HC15 HIVneg 16 HC16 HIVneg 17 HC17 HIVneg 18 HC18 HIVneg 19 HC19 HIVneg 20 HC20 HIVneg 21 HC21 HIVneg 22 HC22 HIVneg [0035] Przeprowadzono komplementarne analizy genomowe, proteomiczne oraz sygnalizacji komórkowej przy zastosowaniu odpowiednio: seryjnej analizy ekspresji genów (Serial Analysis Gene Expression, SAGE), powierzchniowo wzmocnionej laserowej desorpcji/jonizacji z analizą czasu przelotu (SELDI-TOF, Ciphergen ) oraz techniki Power blotting (zob. punkt Materiały i metody). Zrozumienie genetycznych i fizjologicznych czynników występujących u osób zakaŝonych, u których przez długi czas nie dochodzi do rozwoju AIDS (Long Term Progressors, LTNP) oraz osób eksponowanych, lecz niezakaŝonych (Exposed Uninfected, EU) w zakresie naturalnych mechanizmów antywirusowych mogłoby stanowić podstawę do opracowania leczenia przeciw zakaŝeniu wirusem HIV. Wynalazcy przeprowadzili badanie mechanizmów fizjopatologicznych, analizując brak zakaŝenia u osób naraŝonych na częsty kontakt z wirusem HIV (EU). [0036] Pierwsze wyniki uzyskane na podstawie duŝej liczby znaczników genowych (osoby zdrowe z grupy kontrolnej (HC): znaczników, grupa EU: znaczników, osoby zakaŝone HIV+: znaczników) w analizach transkryptomicznych metodą SAGE uwidoczniły podwyŝszoną ekspresję Th1 IL-22 i SOCS1 w grupie EU, a takŝe obniŝoną ekspresję granzymu B w kohorcie HIV+ w stosunku do kohorty EU i kohorty osób zdrowych (NC), u których stwierdzono zbliŝone poziomy ekspresji (Tabela 3). Wyniki te uzyskano bez Ŝadnych oczekiwań a priori".

16 EP B1 Analiza SAGE Poziom ekspresji genów [0037] GEN Osoby zdrowe Grupa ESN Grupa HIV + IL SOCS Granzym B 3,91 3,96 0 Analiza Power blot Poziom ekspresji białek [0038] BIAŁKO Osoby zdrowe Grupa ESN Grupa HIV + STAT [0039] Równolegle, stosując analizę Power blot białek z puli limfocytów T uzyskanych w 3 kohortach uczestników badania, wykryto czynnik reakcji ostrej fazy STAT3. Badania osocza (metodą SELDI-TOF) pobranego od 25 osób z kaŝdej kohorty ukazały nasilenie ekspresji rozpuszczalnego białka o masie cząsteczkowej 8.6 kda (Fig. 2). [0040] Uwzględniając fakt, Ŝe IL-22 inicjuje kaskadę (Fig. 3) wrodzonej odpowiedzi odpornościowej obejmującej szlak Jack/STAT, SOCS 3, beta-defensyny oraz apolipoproteinę ostrej fazy surowiczy amyloid A (A-SAA): SAA-1 i SAA2, dane poddano dalszemu opracowaniu przy uŝyciu róŝnych metod, aby móc potwierdzić i rozszerzyć ich znaczenie (zob. punkt Materiały i metody). Wykazano, Ŝe białko ASAA, syntezowane w wątrobie i innych tkankach, np. nabłonku naczyń krwionośnych, występuje w osoczu w postaci związanej i niezwiązanej z HDL. Promotor białka A-SAA wykazuje wysoki stopień reaktywności w stosunku do cytokin zapalnych, np. IL1β, TNFα; IFNγ i IL6, które mogą być indukowane przez LPS. Ponadto w ostatnim czasie wykazano, Ŝe IL-22 (cytokina Th1) moŝe uczestniczyć w ekspresji A-SAA. Obserwacje te sugerują, Ŝe A-SAA moŝe być cząstką stanowiącą lokalny element wrodzonej obrony immunologicznej. Pęknięcie post-transdukcyjne A-SAA daje fragmenty C-końcowe o masie cząsteczkowej ok. 8,5 kda. W celu identyfikacji białka o wielkości 8,6 kda uzyskanego w analizie SELDI-TOF,

17 EP B1 zastosowano swoiste przeciwciało monoklonalne anty-a-saa przed profilowaniem osocza SELDI-TOF oraz jak pokazano na Fig. 4 odnotowano zanik piku odpowiadającego rejonowi wielkości 8,6 kda w obecności tego przeciwciała monoklonalnego (anty-a-saa). Co ciekawe, wiadomo równieŝ, Ŝe A-SAA posiada zdolność indukcji cytokiny IL-8, w związku z czym przeprowadzono analizę RT-PCR ukierunkowaną na IL-8 u 5 osób z kaŝdej kohorty, aby zweryfikować, czy cytokina ta jest charakterystyczna dla kaskady zdarzeń u osób z grupy EU. Wykres PCR na Fig. 5 potwierdza istnienie swoistego polimorfizmu IL-8 u osób z grupy EU w przeciwieństwie do pozostałych dwóch grup (HIV+ and HC). Przeprowadzono takŝe analizę RT-PCR dla IL-22 (Fig. 6) dla kaŝdej osoby z puli. Zaobserwowano, Ŝe istotna nadekspresja tej waŝnej cytokiny Th1 występuje jedynie w grupie EU. [0041] Wykonano równieŝ inne analizy kontrolne i walidacje, w ramach których metodą Western blot badano białko z próbek łączonych. W grupie EU zaobserwowano takŝe fosforylację STAT1 i STAT3 (Fig. 7A i 7B). W grupie HIV+ stwierdzono z kolei regulację STAT5 w dół, przy czym poziom aktywacji był wyŝszy i niezmieniony zarówno w grupie kontrolnej osób zdrowych (NC), jak i w grupie EU (Fig. 7C). Ekspresja białka SOCS3 (Fig. 7D), genu aktywowanego przez STAT3, w grupie EU wykazywała regulację w górę. U osób z kohorty EU stwierdzono ponadto podwyŝszoną ekspresję alfa-defensyn. Wykazano równieŝ, Ŝe IL-8 ma zdolność desensytyzacji koreceptorów HIV za pośrednictwem rodziny receptorów FPR oraz Ŝe STAT1 odgrywa niezbędną rolę w mediowanej przez komórkowy czynnik przeciwwirusowy (CAF) inhibicji procesu aktywacji LTR (długich terminalnych powtórzeń) HIV-1 i replikacji HIV. [0042] PoniewaŜ agoniści FPR i FPRL1, rozpuszczalne białko A-SAA, peptyd WKYMWVm, bakteryjny peptyd chemotaktyczny fmlf oraz prawdopodobnie jego fragment o wielkości 8,6 kda, indukują proces fosforylacji, jak pokazano w naszych eksperymentach z uŝyciem A-SAA w swoistej analizie techniką Western blot (Fig. 8) oraz modulację w dół koreceptorów HIV-1 CCR5 i CXCR4 poprzez aktywację FPR, zgodnie z doniesieniami [31, 38] zademonstrowano, Ŝe białko A-SAA hamuje zakaŝenie wirusem HIV-I (Fig. 9). Białko A-SAA (Peprotech ) wykorzystane w wykonanych oznaczeniach wykazuje obecność fragmentu o wielkości 8,6 kda (Fig. 10). [0043] Wyniki te pozwoliły na zidentyfikowanie kaskady zdarzeń wspomagających wrodzoną odporność gospodarza na zakaŝenie wirusem HIV, która charakteryzuje osoby EU. PoniewaŜ IL-22, za pośrednictwem szlaku JAK/STAT, ma zdolność indukowania beta-defensyn i A-SAA, a A-SAA indukuje wydzielanie IL-8, uzyskane wyniki są zgodne z

18 EP B1 opisaną kaskadą. Zademonstrowano równieŝ, Ŝe IL-8 i β-defensyna obniŝają poziom zakaŝenia wirusem HIV-I. Ogólnie uzyskane przez nas wyniki pokazują, Ŝe IL-22 jest cytokiną inicjującą, która sprzyja wrodzonej odpowiedzi odpornościowej aktywującej mechanizmy odpornościowe skierowane przeciw zakaŝeniu HIV (Fig. 2).\ [0044] Dodatkowo analiza SAGE dowodzi regulacji w dół granzymu B u osób HIV+, przy standardowym poziomie regulacji u osób z grupy EU i grupy zdrowej (HC). Potwierdza to spostrzeŝenie o utracie granzymu u osób zakaŝonych HIV leczonych według schematu HAART [2, 3]. Podczas analizy SAGE wynalazcy zaobserwowali takŝe wyŝszą produkcję IFN-gamma u osób z grupy EU niŝ u osób zdrowych z grupy kontrolnej (HC) oraz osób HIV+. Cytokiny te wykazują zwykle właściwości przeciwwirusowe, co potwierdzono w niektórych badaniach prowadzonych wśród osób EU przez innych badaczy. [0045] Uwzględniając fakt, Ŝe opisana kaskada zdarzeń prowadzi do indukcji kilku istotnych składowych wrodzonej odporności, zakres niniejszego wynalazku poza HIV rozciąga się równieŝ na inne wirusy i retrowirusy. [0046] NaleŜy równieŝ wziąć pod uwagę podwyŝszony poziom fosforylowanego czynnika STAT1 u osób z grupy EU oraz kluczowe znaczenie tego faktu dla aktywności komórkowych czynników przeciwwirusowych (CAF) wydzielanych przez limfocyty T CD8. Ukazano takŝe, Ŝe w porównaniu z grupą EU oraz zdrową grupą kontrolną, osoby HIV+ mają obniŝony poziom granzymów B. Granzymy B wytwarzane są przez limfocyty T CD8 oraz komórki NK w celu eliminacji zakaŝonych komórek. Warunkowana przez STAT-1 produkcja granzymów B CAF odgrywa istotną rolę w mechanizmach aktywności anty-hiv u osób, u których nie doszło do rozwoju AIDS pomimo zakaŝenia wirusem HIV. [0047] W analizie SAGE zaobserwowano takŝe zwiększoną produkcję IFN-gamma u osób z grupy EU niŝ u osób zdrowych z grupy kontrolnej (HC) oraz osób HIV+. Cytokina ta wykazuje zwykle działanie przeciwwirusowe. [0048] Te elementy kaskady powinny być zaangaŝowane nie tylko jako element odporności na zakaŝenie wirusowe, lecz równieŝ jako składnik odporności na indukowaną chorobę.

19 EP B1 ZastrzeŜenia patentowe 1. Interleukina-22 (IL-2) stosowana w profilaktyce chorób zakaźnych poprzez stymulowanie wrodzonej odpowiedzi odpornościowej. 2. IL-22 w zastosowaniu według zastrz. 1, znamienna tym, Ŝe ma postać cytokiny połączonej z farmaceutycznie obojętnym nośnikiem. 3. IL-22 w zastosowaniu według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, Ŝe leki są przygotowywane w postaci preparatów do stosowania doustnego, aplikacji na śluzówki lub na drodze iniekcji. 4. IL-22 w zastosowaniu według zastrz. 3, znamienna tym, Ŝe leki do podawania doustnego mają postać tabletek, pigułek, kapsułek, kropli, plastrów miejscowych lub aerozolu. 5. IL-22 w zastosowaniu według zastrz. 4, znamienna tym, Ŝe leki do podawania w drodze iniekcji opracowane są w postaci roztworu do iniekcji doŝylnych, podskórnych lub domięśniowych, z wykorzystaniem sterylnego lub sterylizowalnego roztworu, zawiesiny lub emulsji. 6. IL-22 w zastosowaniu według zastrz. 4, znamienna tym, Ŝe leki do podawania na śluzówki mają postać Ŝelów.

20 EP B1 Skrót Interleukina-22 (IL-2) stosowana w profilaktyce chorób zakaźnych poprzez stymulowanie wrodzonej odpowiedzi odpornościowej ma postać cytokiny połączonej z farmaceutycznie obojętnym nośnikiem, zaś leki sporządzone na bazie IL-2 mają postać: tabletek, pigułek, kapsułek, kropli, plastrów miejscowych lub aerozolu do podawania doustnego, Ŝelów na śluzówki oraz roztworu do iniekcji doŝylnych, podskórnych lub domięśniowych, z wykorzystaniem sterylnego lub sterylizowalnego roztworu, zawiesiny lub emulsji. (6 zastrzeŝeń)