Zaburzenie funkcji trzustki u pacjentów z przewlekłym stanem zapalnym i środowiskowo narażonych na dym papierosowy. Mariola Śliwińska-Mossoń

Transkrypt

1 Zaburzenie funkcji trzustki u pacjentów z przewlekłym stanem zapalnym i środowiskowo narażonych na dym papierosowy Mariola Śliwińska-Mossoń Praca wykonana w Zakładzie Biomedycznych Analiz Środowiskowych Akademii Medycznej we Wrocławiu Promotor: Prof. dr hab. n. farm. Halina Milnerowicz Recenzenci: Prof. dr hab. Kazimierz Gąsiorowski Prof. dr hab. Janusz Madej

2 Przewlekłe zapalenie trzustki (PZT) Jest chorobą charakteryzującą się nieodwracalnymi zmianami morfologicznymi w postaci postępującego uszkodzenia zewnątrz- i wewnątrzwydzielniczych struktur komórkowych oraz przewodów trzustkowych, z następowym rozwojem tkanki łącznej, postępującym upośledzeniem sprawności zewnątrzwydzielniczej, a w późniejszych etapach wewnątrzwydzielniczej. PZT jest chorobą dotykającą głównie mężczyzn (70 80% chorych) pomiędzy 35. a 45. rokiem życia. Częstość występowania PZT w krajach wysoko uprzemysłowionych określa się na 4 przypadki na 100 tys. mieszkańców. W Polsce wskaźnik zachorowalności na PZT wynosi 5 10 przypadków na 100 tys. mieszkańców.

3 KLASYFIKACJA PRZEWLEKŁYCH STANÓW ZAPALNYCH TRZUSTKI oparta na czynnikach ryzyka rozwoju choroby, tzw. system TIGAR O. T toksycznometaboliczne (alkohol, palenie tytoniu, hiperkalcemia przewlekła niewydolność nerek) I idiopatyczne G genetyczne (mutacje genu kationowego trypsynogenu, mutacje genów SPINK1 i CFTR) A autoimmuno logiczne R powstałe w wyniku nawracających zapaleń lub ciężkich postaci ostrego zapalenia trzustki O zaporowe PZT (obstructive ) Stres oksydacyjny Toksyczne metabolity Nekroza / włóknienie Wapnienie Hipoteza komórek gwiaździstych Poszerzone przewody PZT

4

5

6 Patogenetyczny mechanizm uszkodzenia trzustki przez nikotynę zaproponowany przez Chowdhury i wsp. AKTYWACJA I NADEKSPRESJA PROTOONKOGENÓW I PIERWSZYCH PRZEKAŹNIKÓW NIKOTYNA AKTYWACJA RECEPTORA PROCESU TRANSDUKCJI SYGNAŁU AKTYWACJA I MUTACJA PROTOONKOG ENU (GEN H ras) TRANSFORMACJA I PROLIFERACJA KOMÓRKI WZROST STĘŻENIA WAPNIA W CYTOZOLU KARCINOGENEZA? USZKODZENIE I ŚMIERĆ KOMÓRKI

7 CEL PRACY Celem pracy było wykazanie wpływu palenia tytoniu: na funkcję śródbłonka naczyniowego (entotelinę-1), stężenie prozapalnej cytokiny (interleukiny-6), na czynność zewnątrzwydzielniczą (enzymy trzustkowe) i wewnątrzwydzielniczą (glukoza, hormony trzustkowe) trzustki oraz na ekspresję białka p53 u zdrowych osób i pacjentów z przewlekłym nawracającym i przewlekłym zapaleniem trzustki.

8 MATERIAŁ (1/3) surowica, osocze, skrawki tkankowe trzustki. Materiał pobrano od pacjentów hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Chirurgii Przewodu Pokarmowego i Chirurgii Ogólnej Akademii Medycznej we Wrocławiu. Materiał biologiczny był gromadzony w latach Na wykonanie badań na pobranym materiale klinicznym uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej we Wrocławiu (Nr KB: 735/2004). Badania wykonano w ramach GU-1320 i GU-1668.

9 MATERIAŁ (2/3) Krew Krew żylną pobierano w dniu przyjęcia chorego do leczenia. Badania wykonano u 113 osób: 33 pacjentów (w wieku lat) z rozpoznaniem przewlekłego zapalenia trzustki (PZT), 30 pacjentów (w wieku lat) z rozpoznaniem przewlekłego nawrotowego zapalenia trzustki (PNZT), grupę kontrolną stanowiło 50 zdrowych ochotników, spośród personelu medycznego i studentów Akademii Medycznej (w wieku lat).

10 MATERIAŁ (3/3) 2. Materiał tkankowy pobrano od: 19 pacjentów z rozpoznaniem PZT, 4 skrawki tkankowe z każdej części anatomicznej zdrowej trzustki. 58% przypadków materiał pobrano z ogona trzustki; 11% przypadków materiał pobrano z trzonu trzustki 31% przypadków materiał pobrano z głowy trzustki

11 METODY (1/2) 1. Metodą immunoenzymatyczną oznaczono stężenia: metabolitów nikotyny w osoczu (według Wielkoszyńskiego) endoteliny-1 w osoczu (Nr kat.: BBE5, R&D Systems, USA); IL-6 w surowicy (Nr kat.: DY206, R&D Systems, USA), insuliny w osoczu (Nr kat. K6219; DakoCytomation, UK); 2. Metodą kolorymetryczną oznaczono: stężenia glukozy (metoda oksydazowa (GOD/POD)) aktywności lipazy (z użyciem substratu 1,2-o-dilaurylo-rac-glicero-3-glutarowego kwasowego-(6-metyloresorufin) estru aktywności amylazy (z użyciem substratu: etylideno-g7-pnp wg Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej) aktywności formy termolabilnej amylazy w surowicy (według Zakrzewskiej)

12 METODY (2/2) 3. Immunohistochemia: Immunohistochemiczną lokalizację: IL-6, hormonów trzustkowych: białka p53 insuliny, glukagonu, somatostatyny, polipeptydu trzustkowego, w tkankach trzustki dokonano z użyciem specyficznych przeciwciał i z zastosowaniem testu wizualizacyjnego LSAB2-HRP (Nr kat.: K0637, DAKO, USA). Została dokonana histopatologiczna ocena intensywności barwienia skrawków tkankowych w kierunku IL-6, hormonów i p53,

13 Analiza mikrodensymetryczna ekspresji hormonów w preparatach histochemicznych. Wszystkie preparaty tkankowe oglądano pod mikroskopem świetlnym Zeiss Photomicroskope-Axiophot (Zeiss Corporation, Frankfurt, Germany), skoniugowanym z aparatem cyfrowym CC20P Camera przystosowanym do naukowych badań (Videotronic International, Germany). Pomiary wykonano za pomocą mikrokomputerowego analizatora obrazu, stosując program pomiarowy komputerowy Multi-Scan Base V.8 pracujący w środowisku Windows. Za pomocą tego programu w obrębie zaznaczonego obszaru pojedynczej wyspy Langerhansa zmierzono rozkład jasności wszystkich punktów. Natężenie barwnych reakcji oceniano w arbitralnych jednostkach gęstości optycznej (ang. arbitrary units: A.U.). W analizie wykorzystano poziom intensywności zabarwienia, który był proporcjonalny do wartości liczbowej zawartości hormonu w komórce. Do analizy obrazu uwzględniano tylko przestrzeń cytoplazmatyczną komórek wysp trzustkowych, przy obliczeniach nie brano pod uwagę jąder komórkowych ze względu na możliwość otrzymania fałszywie dodatniego wyniku.

14 ANALIZA STATYSTYCZNA Wyniki oznaczeń w stanach zapalnych trzustki analizowano następującymi testami statystycznymi : t-studenta, U-Manna Whitneya, testy jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), Dla określenia związku korelacyjnego pomiędzy mierzonymi parametrami, wykorzystano test istotności współczynnika korelacji Spearmana. Testowanie istotności przeprowadzono na poziomie p<0,05. Do obliczeń wykorzystano program Satistica 6.0 PL.

15 WYNIKI 1. Stężenie metabolitów nikotyny w osoczu Metabolity nikotyny Kontrola pacjenci pacjenci [ng/ml] z PNZT z PZT X ± SD 309,5 ± 155,0 367,9 ±82,2 288,3±129,4

16 2. Stężenie endoteliny-1 w osoczu **/ 3 * ET-1 [pg/ml] 2,5 2 1,5 1 0,5 */** Palący Niepalący Kontrola PNZT PZT różnice istotne statystycznie: grupa kontrolna osób niepalących grupa kontrolna osób palących: *p=0,003; grupa kontrolna osób niepalących palący z PNZT: **p=0,000 niepalący z PNZT palący z PNZT: p=0,000

17 3.Stężenie interleukiny-6 w surowicy **/ 20 IL-6 [pg/ml] */**/***/ **** *** */ Kontrola PNZT PZT różnice istotne statystycznie pomiędzy stężeniem IL-6 u osób niepalących z grupy kontrolnej a: - niepalący z PNZT: *p=0,000, - palący z PNZT: p**=0,000, - niepalący z PZT: ***p=0,04, - palący z PZT: ****p=0,002, - grupa kontrola osób palących: ***p=0,04 Niepalący z PNZT - palący z PNZT: p=0,000 *** **** Palący Niepalący

18 4. Immunohistochemiczna lokalizacja interleukiny-6 w tkance prawidłowej i zmienionej zapalnie Głowa Trzon Ogon Zdrowa trzustka A. B. C. D. E. F. Niepalący z PZT Palący z PZT G. H. I. Immunohistochemiczna lokalizacja IL-6 w: A,D,G. głowie, B,E,H. trzonie, C,F,I. ogonie trzustki.

19 5. Aktywność lipazy w surowicy * Aktywność lipazy [U/L] * * * * Kontrola PNZT PZT * Palący Niepalący różnice istotne statystycznie: grupa osób zdrowych niepalących pozostałe grupy: *p=0,000

20 6. Całkowita aktywność amylazy i jej termolabilnej formy w surowicy Całkowita aktywność amylazy [U/L] ** * ** * Kontrola PNZT PZT Palący Niepalący Różnice istotne statystycznie: niepalący palący: *p=0,0003; **p=0,0005; Aktywność formy termolabilnej amylazy [U/L] ** * *** ** * *** Kontrola PNZT PZT Palący Niepalący Różnice istotne statystycznie: niepalący palący: *p=0,002; **p=0,007; ***p=0,009

21 7. Stężenie glukozy w surowicy Glukoza [mg/dl] */** * ** * * ** Palący Niepalący 8. Stężenie insuliny w osoczu Kontrola PNZT PZT różnice istotne statystycznie pomiędzy stężeniem glukozy u osób niepalących z grupy kontrolnej a: - grupa kontrola osób palących: *p=0,001 - niepalący z PNZT: *p=0,001 - niepalący z PZT: *p=0,001; - palący z PNZT: **p=0, palący z PZT: **p=0,0001 Insulina [µu/ml] */**/ *** * *** ** * * Kontrola PNZT PZT Palący Niepalący różnice istotne statystycznie pomiędzy stężeniem insuliny u osób niepalących z grupy kontrolnej a: - grupa kontrola osób palących: *p=0, palący z PNZT: *p=0, palący z PZT: *p=0,0000; - niepalący z PNZT: **p=0,0006, - niepalący z PZT: ***p=0,001;

22 9. Immunohistochemiczna lokalizacja insuliny Głowa Trzon Ogon Zdrowa trzustka A. B. D. E. C. Niepalący z PZT F. Palący z PZT G. H. I. Immunohistochemiczna lokalizacja insuliny w: A,D,G. głowie; B,E,H. trzonie; C,F,I. ogonie trzustki.

23 10. Analiza mikrodensymetryczna insuliny różnice istotne statystycznie */**p<0,05 Ekspresja insuliny określona za pomocą analizy densymetrycznej w zdrowej tkance, niepalących i palących pacjentów z PZT wyrażona w jednostkach gęstości optycznej (A.U.).

24 11. Immunohistochemiczna lokalizacja glukagonu Głowa Trzon Ogon Zdrowa trzustka A. B. C. Niepalący z PZT D. E. F. Palący z PZT G. H. I. Immunohistochemiczna lokalizacja glukagonu w: A,D,G. głowie; B,E,H. trzonie; C,F,I. ogonie trzustki.

25 12. Analiza mikrodensymetryczna glukagonu różnice istotne statystycznie */**p<0,05 Ekspresja glukagonu określona za pomocą analizy densymetrycznej w zdrowej tkance oraz niepalących i palących pacjentów z PZT wyrażona w jednostkach gęstości optycznej (A.U.).

26 13. Immunohistochemiczna lokalizacja somatostatyny Głowa Trzon Ogon Zdrowa trzustka A. B. C. Niepalący z PZT D. E. F. Palący z PZT G. H. I. Immunohistochemiczna lokalizacja somatostatyny w: A,D,G. głowie; B,E,H. trzonie; C,F,I. ogonie trzustki.

27 14. Analiza mikrodensymetryczna somatostatyny różnice istotne statystycznie */**p<0,05 Ekspresja somatostatyny określona za pomocą analizy densymetrycznej w zdrowej tkance oraz niepalących i palących pacjentów z PZT wyrażona w jednostkach gęstości optycznej (A.U.).

28 15. Immunohistochemiczna lokalizacja polipeptydu trzustkowego Głowa Trzon Ogon Zdrowa trzustka A. B. C. D. E. F. Niepalący z PZT Palący z PZT G. H. I. Immunohistochemiczna lokalizacja PP w: A,D,G. głowie; B,E,H. trzonie; C,F,I. ogonie trzustki.

29 16. Analiza mikrodensymetryczna PP różnice istotne statystycznie */**p<0,05 Ekspresja polipeptydu trzustkowego określona za pomocą analizy densymetrycznej w zdrowej tkance oraz niepalących i palących pacjentów z PZT wyrażona w jednostkach gęstości optycznej (A.U.).

30 17. Immunohistochemiczna lokalizacja białka p53 u pacjentów z PZT. Zdrowa trzustka Niepalący z PZT A. B. Palący z PZT Palący z PZT C. D.

31 Parametry diagnostyczne zmian metabolicznych w trzustce Wzrost poziomu ET-1[pg/ml] 2,5 2 1,5 1 0,5 niepalący palący Wzrost poziomu glukozy[mg/dl] niepalący palący Spadek poziomu insuliny [µu/ml] Czynnik etiologiczny: Palenie papierosów nie do końca wyjaśnione procesy wewnątrzkomórkowe powodujące uszkodzenie komórek trzustki RFT ZDROWI Parametry diagnostyczne stanów zapalnych trzustki Wzrost poziomu IL-6[pg/ml] 2 1,5 1 0,5 niepalący palący Wzrost aktywności lipazy[u/l] niepalący palący Wzrost aktywności termolabilnej amylazy[u/l] niepalący palący Schorzenia trzustki: zapalenia trzustki cukrzyca nowotwór?! niepalący palący

32 Parametry diagnostyczne zmian metabolicznych w trzustce Wzrost poziomu ET-1[pg/ml] 1,5 1 0,5 niepalący zdrowi niepalący z PZT palący z PZT Wzrost poziomu glukozy[mg/dl] Czynniki eeologiczne: przewlekły stres oksydacyjny Insulina alkohol/palenie tytoniu tło kamicze i przyczyny zaporowe genetyczne i diopatyczne nie do końca wyjaśnione procesy wewnątrzkomórkowe powodujące uszkodzenie komórek trzustki Komórki zapalne przebyte epizody OZT Parametry diagnostyczne stanów zapalnych trzustki 2,5 2 1,5 1 0,5 Wzrost poziomu IL-6[pg/ml] niepalący niepalący palący z zdrowi z PZT PZT Wzrost aktywności lipazy[u/l] niepalący niepalący z zdrowi PZT palący z PZT Spadek poziomu insuliny [µu/ml] glukagon somatostatyna PZT p niepalący niepalący palący z zdrowi z PZT PZT Wzrost aktywności termolabilnej amylazy[u/l] niepalący zdrowi niepalący z PZT palący z PZT PP Niepalący z PZT Palący z PZT Niepalący z PZT Palący z PZT niepalący zdrowi niepalacy z PZT palący z PZT

33 Parametry diagnostyczne zmian metabolicznych w trzustce Wzrost poziomu ET-1[pg/ml] Czynniki eeologiczne: alkohol/palenie tytoniu tło kamicze i przyczyny zaporowe genetyczne i diopatyczne Parametry diagnostyczne stanów zapalnych trzustki Wzrost poziomu IL-6[pg/ml] 3 2,5 2 1,5 1 0,5 niepalący zdrowi niepalący z PNZT palący z PNZT PZT niepalący zdrowi niepalący z PNZT palący z PNZT Wzrost poziomu glukozy[mg/dl] niepalący zdrowi niepalący z PNZT palący z PNZT przewlekły stres oksydacyjny nie do końca wyjaśnione procesy wewnątrzkomórkowe powodujące uszkodzenie komórek trzustki RFT RFT częste epizody OZT Wzrost aktywności lipazy[u/l] niepalący zdrowi niepalący z PNZT palący z PNZT Spadek poziomu insuliny [µu/ml] PNZT Wzrost aktywności termolabilnej amylazy[u/l] 10 5 niepalący zdrowi niepalący z PNZT palący z PNZT niepalący zdrowi niepalacy z PNZT palący z PNZT

34 WNIOSKI (1/2) 1. Wzrost stężenia endoteliny-1 w osoczu palących osób zdrowych i pacjentów z nawrotowym zapaleniem trzustki oznacza zwiększone uwalnianie tego peptydu ze śródbłonka naczyń krwionośnych i tym samym zwiększoną ich przepuszczalność. Obniżenie szczelności naczyniowej może ułatwiać przedostanie się markerów stanu zapalnego do krążenia ogólnego i przyczyniać się do późniejszych powikłań systemowych. 2. Palenie papierosów zwiększa poziom cytokiny prozapalnej IL-6 u zdrowych osób, oraz u pacjentów z PNZT, przyczyniając się do nasilenia procesu zapalnego trzustki. 3. Palenie papierosów zaburza funkcję zewnątrzwydzielniczą trzustki u zdrowych osób i pacjentów z zapaleniem trzustki, co manifestuje się wzrostem aktywności amylazy i jej formy termolabilnej oraz lipazy we krwi. 4. Istnieje ścisła zależność pomiędzy paleniem papierosów, a zwiększającym się poziomem glukozy i zmniejszającym się poziomem insuliny we krwi zarówno u osób zdrowych jak i chorych.

35 WNIOSKI (2/2) 5. Palenie papierosów zwiększa ryzyko powstawania zwłóknień i zwapnień miąższu przez co pogłębia dysfunkcję egzo- i endnokrynną trzustki u pacjentów ze stanem zapalnym. 7. Palenie papierosów u chorych na PZT powoduje znaczną redukcję liczby komórek B i A, a zwiększenie ilości komórek D i PP oraz zmianę ich lokalizacji w wyspach i miąższu trzustki. 9. Badania mikrodensymetryczne ekspresji hormonów w tkankach trzustki zmienionej zapalnie, pochodzącej od palących pacjentów potwierdziły istotnie niższą ekspresję insuliny i glukagonu oraz wyższą ekspresję somatostatyny i polipeptydu trzustkowego w porównaniu do niepalących chorych oraz zdrowych osób. Dowodzi to o istotnej roli palenia tytoniu w powstawaniu zaburzeń endokrynnych w przebiegu PZT. 10. Zwiększoną ekspresję białka p53 w trzustce stwierdzono u 42% palących pacjentów z rozpoznanym przewlekłym zapaleniem trzustki.

36 Publikacje związane z tematem pracy doktorskiej: 1. Milnerowicz H., Śliwińska M, Jabłonowska M., Milnerowicz S.: Wpływ palenia papierosów na poziom amylazy u pacjentów z procesem zapalnym trzustki. Przegl. Lek. 2004, 61: Śliwińska-Mossoń M, Milnerowicz H.: Tobacco smoking and the diseases of pancreas. Przegl.Lek. 2005, 62: Śliwińska-Mossoń M, Milnerowicz H. Influence of tobacco smoking on lipase activity in patients with pancreatitis Przegl. Lek. 2005, 62: Śliwińska-Mossoń M, Milnerowicz H, Milnerowicz S, Rabczyński J. Immunohistochemical localization of p53 protein in smoking patients with chronic pancreatitis Przegl. Lek. 2006, 63: Milnerowicz H, Śliwińska-Mossoń M, Rabczyński J, Nowak M, Milnerowicz S. Dysfunction of the pancreas in healthy smoking persons and patients with chronic pancreatitis. Pancreas 2006; 34,1: Śliwińska-Mossoń M, Milnerowicz H.: The activity of thermolability amylase in serum nonsmoking and smoking healthy persons and patients with pancreatitis. Przegl. Lek. 2008; 65, 10: Publikacje niezwiązane z tematem pracy doktorskiej: 7. Rabczyński J, Milnerowicz H, Śliwińska-Mossoń M, Jabłonowska M, Milnerowicz S, Knast W, Zabel M. Hormone- Producing Serous Cystadenoma of the Pancreas. Neoplasma 2006; 53, 6: Milnerowicz H, Śliwińska-Mossoń M, Kasprzyk I.: Wpływ palenia papierosów na wydolność fizyczną młodych kobiet (część I) Przegl. Lek. 2007;64, 10: Milnerowicz H, Śliwińska-Mossoń M.: Wpływ palenia papierosów na wydolność fizyczną młodych mężczyzn (część II) Przegl.Lek. 2007; 64, 10: Śliwińska-Mossoń M, Milnerowicz H, Zuchniewicz A, Andrzejak R, Antonowicz-Juchniewicz J: Wpływ palenia papierosów na aktywność amylazy w surowicy osób narażonych zawodowo na metale ciężkie. Przegl.Lek. 2008; 65, 10: Śliwińska-Mossoń M., Milnerowicz H, Rabczynski J, Milnerowicz S. Immunohistochemical localization of metallothionein and p53 protein in pancreatic serous cystadenomas. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis (AITE), 2009, 57. (praca w druku)

37 Dziękuję za uwagę

38 Zaburzenie funkcji trzustki u pacjentów z przewlekłym stanem zapalnym i środowiskowo narażonych na dym papierosowy Mariola Śliwińska-Mossoń Praca wykonana w Zakładzie Biomedycznych Analiz Środowiskowych Akademii Medycznej we Wrocławiu Promotor: Prof. dr hab. n. farm. Halina Milnerowicz Recenzenci: Prof. dr hab. Kazimierz Gąsiorowski Prof. dr hab. Janusz Madej