Aparatura do badań spektroskopowych

Transkrypt

1 Aparatura do badań spektroskopowych Spektrofotometr Do rejestracji widm absorpcji używany jest spektrofotometr V-55 (Jasco) i Specord UV-VIS (Zeiss) oraz jeśli to konieczne to także Cary-3 (Varian). Spektrofotometry te są przyrządami dwuwiązkowymi. Oznacza to, że jeżeli oprócz badanego związku absorbuje również rozpuszczalnik i/lub zawarte w nim zanieczyszczenia (jeśli takowe się w nim znajdują), to przy pomiarze, gdzie w torze referencyjnym znajdować się będzie kuweta z rozpuszczalnikiem, którego używamy do badań, a w torze pomiarowym nasza próba, to wartość absorbancji wskazywana przez przyrząd będzie oznaczała faktyczną absorbancję próbki, a nie również rozpuszczalnika (i ewentualnych zanieczyszczeń) ponieważ zostanie ten wpływ skompensowany. Spektrofotometr do badania absorpcji elektronowej rejestruje stosunek intensywności promieniowania wychodzącego z próbki (I) do intensywności promieniowania padającego na próbkę (I o ). Stosunek I/I nazywany jest transmitancją i jest rejestrowany jako funkcja częstości padającego na próbkę promieniowania. Rysunek 1 przedstawia typowy schemat układu optycznego spektrofotometru. Źródłem światła w zakresie 35-7nm jest lampa wolframowa, a w zakresie 18-4nm lampa wodorowa lub deuterowa. Podczas pomiaru absorpcji promieniowanie ze źródła światła (odpowiedniej lampy) prowadzone jest wzdłuż głównej osi optycznej, a po przejściu przez siatkę dyfrakcyjną coraz to inne częstości promieniowania padają na sektor wirujący, który rozdziela wiązkę na dwie, z których jedna pada na próbkę, a druga na odnośnik (zwykle rozpuszczalnik). Kolejny sektor wirujący miesza obie wiązki wychodzące z próbki i kieruje na fotopowielacz, w którym następuje zamiana impulsów świetlnych na elektryczne. Mierzony sygnał trafia do komputera gdzie obliczany jest stosunek I/I dla danej, zadanej długości fali. 1

2 Rys.1 Schemat dwuwiązkowego spektrofotometru na przykładzie V-55 (Jasco). Spektrofotometr Jasco V-55 Wszystkie funkcje spektrofotometru V-55 sterowane są za pomocą komputera. Podstawowe parametry przyrządu zostały zebrane poniżej: tryb fotometryczny: ABS pomiar absorbancji, %T pomiar transmitancji, %R pomiar reflektancji, Sample pomiar jednowiązkowy dla wiązki pomiarowej, Reference - pomiar jednowiązkowy dla wiązki odniesienia, czas uśredniania wartości pomiarowych: Quick ok..3 s, Fast.25 s, Medium 1 s, Slow 4 s, szerokość spektralna szczelin [nm]:.1;.2;.5; 1; 2; 5; 1, prędkość skanowania długości fali [nm/min]: 1; 2; 4; 1; 2; 4; 1; 2; 4, zakres długości fali [nm]: 19 9, powtarzalność długości fali [nm]:.1, dokładność długości falowej [nm]: ±.3, 2

3 odległość punktów pomiarowych [nm]:.25;.5;.1;.2;.5; 1; 2, dokładność fotometryczna: ±.2 przy absorbancji.5, stabilność linii bazowej: ±.4 ABS / godzinę, światło rozproszone:.15% przy 22 nm, zakres pomiaru: -2 do + 4 absorbancji, kierunek zbierania widma: od dłuższych do krótszy wartości długości fal. Spektrofotometr Cary-3 Spektrofotometr Cary-3 firmy Varian jest także przyrządem dwuwiązkowym, również sterowanym poprzez komputer z monochromatorem typu Czerny-Turner i premonochromatorem. Charakteryzuje się nieco lepszymi parametrami pomiarowymi i większą stabilnością pracy niż opisany powyżej spektrofotometr Jasco V-55: tryb fotometryczny: czas uśredniania wartości pomiarowych 1 [s]:.33 1, szerokość spektralna szczelin [nm]:.2 4., z krokiem co.1 nm, prędkość skanowania długości fali [nm/min]:.1 3, zakres długości fali [nm]: 19-9, powtarzalność długości fali [nm]: <.8, dokładność długości fali [nm]: ±.2, odległość punktów pomiarowych [nm]: 1 Parametry te są od siebie zależne ręcznie można ustawić tylko dwa, trzeci ustawiany jest przez program. 3

4 .2 1, dokładność fotometryczna: ±.6 przy absorbancji.3, stabilność linii bazowej: <.3 ABS / godzinę, światło rozproszone:.5% przy 22 nm, zakres pomiaru: + 5 absorbancji, kierunek zbierania widma: od dłuższych do krótszy wartości długości fal. Zmodernizowany spektrofluorymetr MPF-3 Budowę i zasadę działania spektrofluorymetru przedstawiono na przykładzie spektrofluorymetru MPF-3 produkcji Perkin-Elmer-Hitachi. Schemat blokowy tego aparatu zamieszczono na Rys. 2. Monochromator wzbudzenia Zasilacz lampy ksenonowej Lampa ksenonowa Zasilacz F1 Rodamina B filtry Zasilacz układu chłodzącego F1 1 Monochromator emisji F2 Zasilacz F2 filtry próbka PC Układ liczenia fotonów wzmacniacz wzmacniacz Rys.2 Schemat blokowy zmodernizowanego spektrofluorymetru MPF-3. Spektrofluorymetr MPF-3 firmy Perkin-Elmer-Hitachi w stosunku do oryginału został zmodyfikowany. Dodane zostały: 4

5 fotopowielacz referencyjny, chłodzenie fotopowielacza pomiarowego, detekcja z użyciem liczenia pojedynczych fotonów, stabilniejsze źródło światła sterowanie urządzeniem (nie wszystkie funkcje są dostępne, np. ustawianie długości fali wzbudzenia, emisji, szerokości szczelin itp) i rejestracja widm za pomocą komputera, stabilizacja temperatury kuwety pomiarowej. Źródłem światła jest lampa ksenonowa (o mocy 15W, firmy Hamamatsu), która charakteryzuje się ciągłym widmem promieniowania z zakresu 2-1nm i wyjątkowo dużą stabilnością świecenia (zmiana I <.5% w czasie jednej godziny). Promieniowanie to służy do wzbudzania badanego związku i jest kierowane przez układ soczewek i zwierciadło płaskie do monochromatora toru wzbudzenia. Pomiędzy monochromatorem wzbudzenia, a próbką znajduje się światłodzieląca płytka kwarcowa, która kieruje część wiązki ( 8%) na kuwetę ze stężoną rodaminą B, absorbującą całkowicie padające światło o dowolnej długości fali (w zakresie 2-58nm). Tor referencyjny oprócz kuwety z rodaminą B składa się z filtru przepuszczającego wyłącznie światło emitowane przez rodaminę oraz fotopowielacza odniesienia F2. Układ ten umożliwia skorygowanie widm wzbudzenia poprzez uwzględnienie zmian natężenia padającego promieniowania lampy, a także znajduje zastosowanie jako licznik kwantów do pomiaru wartości natężenia światła padającego na próbkę w przypadku pomiaru wydajności kwantowych emisji oraz porównania intensywności widm emisji badanego związku dla różnych długości fali wzbudzenia. Z monochromatora wzbudzenia, wiązka o wybranej długości fali i zadanej szerokości spektralnej, określanej przez szerokość szczeliny pada na próbkę. Pod kątem 9 do kierunku padania światła wzbudzającego następuje zbieranie emisji promieniowania pochodzącego od badanej próbki. Po zogniskowaniu przez soczewkę promieniowanie to wchodzi do monochromatora emisji. Promieniowanie wychodzące z monochromatora emisji jest ogniskowane przez soczewkę i rejestrowane przez chłodzony (do temperatury 3 C) fotopowielacz pomiarowy F1. Chłodzenie fotopowielacza zapewnia znaczne (ponad 1 krotne) zmniejszenie ciemnego prądu fotopowielacza. Sygnały z fotopowielaczy F1 i F2 (R928 Hamamatsu specjalnie wyselekcjonowane do pomiarów liczenia pojedynczych fotonów) są przekazywane do karty komputera za pomocą wzmacniaczy. Karta ta steruje również pracą 5

6 monochromatorów z użyciem silników krokowych. W celu zmniejszenia intensywności światła rozproszonego oraz wyeliminowania promieniowania pochodzącego od drugiego rzędu ugięcia siatki stosuje się odpowiednio dobrane filtry wstawione za próbką. Inne parametry pomiarowe to: maksymalna wartość mierzonego sygnału emisji [cps]: 5, szerokość spektralna szczelin wzbudzenia i emisji [nm]: 1 4, krok pomiarowy [nm]:.1 1., dokładność ustawienia długości fali wzbudzenia i emisji (wynikająca z działki) [nm]: 2, czas uśredniania wartości pomiarowych [ms]: 1 65, kierunek zbierania widma: od krótszych do dłuższych wartości długości fal. Układ liczenia fotonów (zarówno w torze pomiarowym jak i referencyjnym) służy do rejestracji widm optycznych metodą zliczania pojedynczych fotonów, czyli elektronicznym zliczaniu impulsów odpowiadających pojedynczym fotonom emitowanym przez próbkę i padającym na fotokatodę fotopowielacza. Dzięki takiemu rozwiązaniu możliwe jest badanie widm emisyjnych z równoczesną detekcją natężenia światła wzbudzającego oraz badanie widm wzbudzenia emisji z równoczesną korekcją na rozkład spektralny źródła światła wzbudzającego. W celu zarejestrowania widm ustawia się ręcznie odpowiednie szerokości szczelin wzbudzenia i emisji, które muszą być dobrane tak, aby intensywność emisji nie przekroczyła 5 zliczeń na sekundę tak na fotopowielaczu F1 jak i F2. W tych warunkach oba fotopowielacze pracują liniowo. Długość fali wzbudzenia i początkową długość fali przy pomiarze widma emisji oraz analogicznie długość fali emisji i początkową długość fali w widmie wzbudzenia ustawia się ręcznie. Spektrofluorymetr MPF-3 jest przyrządem jednowiązkowym i dlatego osobno rejestruje się w identycznych warunkach odpowiednie widma dla próbki, tj., dla badanego związku w rozpuszczalniku i dla samego rozpuszczalnika. Widma są rejestrowane na komputerze za pomocą programu Easy Scan, w którym wybiera się 6

7 typ rejestrowanego widma, początkową i końcową wartość długości fali emisji (wzbudzenia) oraz długość fali wzbudzenia (emisji) w przypadku rejestracji widm emisji (wzbudzenia emisji) oraz czas zliczania fotonów dla każdej długości fali w widmie (tzw. czas trwania jednego kroku). 7

8 Metodyka pomiarów widm absorpcji Pomiary absorpcyjne mogą być wykonywane na spektrofotometrze V-55 (Jasco), Specord UV-VIS (Zeiss), a także na Cary-3 (Varian). Pomiary te nie należą do prostych gdy dla badanego związku, np. tetrafenylo porfiryny cynkowej (ZnTPP) obserwuje się bardzo duże zmiany molowego współczynnika ekstynkcji ( ) ZnTPP w całym zakresie widmowym (2-65nm), a przy tym bardzo duże zmiany (prawie o trzy rzędy wielkości) w wąskim zakresie spektralnym pasma Soreta (zaledwie 25nm). Dlatego w celu poprawnego i dokładnego pomiaru wartości absorbancji w szerokim zakresie ( ) należy stosować specjalną metodykę. W pierwszym etapie należy określić czas po jakim spektrofotometr od jego uruchomienia zaczyna pracować stabilnie (co jest związane przede wszystkim z wygrzaniem lamp), a także jaka jest jego stabilność w czasie pracy..4.2 ABS [j.u.] medium.5 medium.5 fast czasy próbkowania:.5 fast =.5 s medium = 1s.5 medium = 2s [nm] Rys.1 Linia zerowa pustego spektrofotometru Cary-3 dla różnych czasów próbkowania. Wykonano szereg testujących pomiarów dla różnych parametrów pracy spektrofotometru (czas zliczania, krok oraz czas zbierania widma w danym zakresie spektralnym), co pozwoliło dobrać najkorzystniejsze warunki pomiarowe pozwalające rejestrować najdokładniej widma absorpcyjne tak co do wartości absorbancji (absorpcji) jak i długości fali, a zarazem przy największym stosunku mierzonego sygnału do szumu elektroniki i największej powtarzalności pomiarów (Rys.1 i 2). 8

9 .4.2 ABS [j.u.] "medium" przed pomiarami "medium" po 5h.5 "medium" przed pomiarami.5 "medium" po 5h czasy próbkowania:.5 fast =.5 s medium = 1s.5 medium = 2s [nm] Rys.2 Linia zerowa pustego spektrofotometru Cary-3 gotowego do pracy i po upływie pięciu godzin pracy. W oparciu o wyniki pomiarów absorpcyjnych można uzyskać ważne wnioski co do własności spektralnych i fotofizycznych badanych związków. Podano to na przykładzie porfiryny ZnTPP, dla której starano się stwierdzić: a) obecność stanu S 2 czy pojawią się zmiany w widmie absorbancji (jego kształcie, wartościach max, min, 1/2 ) wskazujące na obecność stanu S 2 oraz na jego położenie w stosunku do stanu S 2, b) obecność w widmie absorbancji dimerów obok monomeru, a także c) wyznaczyć wydajność kwantową fluorescencji ze stanu S 1 ( F(S 1 )) przy wzbudzeniu zarówno do stanu S 2 jak i S 1. Punkty (a) i (b) wymagają bardzo dokładnych pomiarów widm absorbancji w całym zakresie spektralnym, w którym porfiryny absorbują (tj. 2-65nm), zaś punkt (c) pomiarów absorbancji przy wybranych długościach fal. Aby można wyciągnąć wiarygodne wnioski z tych pomiarów konieczne było wyznaczenie błędu pojedynczego pomiaru absorbancji oraz powtarzalności w pomiarach punktowych i ciągłych. Przykładowe pomiary ilustrujące pracę spektrofotometru Cary-3 zamieszczono w Tabeli 1 (błąd wyznaczenia wartości A obliczono ze wzorów na średnią ważoną). Pomiary nr 1 i 5 to pomiary linii zerowej pustego spektrofotometru. Pomiary 2-4, to 9

10 pomiary absorbancji ZnTPP w n-hexanie, przy czym przed dokonaniem pomiaru nr 4 kuwetkę pomiarową wyjęto i ponownie włożono do spektrofotometru w celu stwierdzenia jak duży błąd można popełnić przy wyznaczeniu absorbancji w wyniku nieidentycznego ustawienie kuwety pomiarowej. Tabela 1. Pomiary absorbancji ZnTPP w n-hexanie, szczelina 4nm, czas integracji 4s. Nr pomiaru = 361,5nm = 47,5nm = 414,5nm A A A Średnia Średnia Średnia 1.,,,,,,,,,,,, 2.,13,12,525,525,14,141,11,525,142,12,525,142 3.,11,12,525,525,144,145,12,525,145,12,525,146 4.,1,11,526,526,145,145,11,526,145,13,526,145 5.,,,,,,,,,,1,, A A,117,9,5253,9,1438,9 Błąd wyznaczenia A,9%,17%,6% Otrzymane wyniki pokazują, że maksymalny błąd wyznaczenia wartości absorbancji dla danej długości fali w pomiarach punktowych wynosił znacznie mniej niż 1%. Ponadto na wielkość błędu nie wpływa ewentualna niepowtarzalność wyjmowania i wkładania kuwetki z próbką. 1

11 Kolejnym ważnym krokiem było dobranie takich warunków pomiaru widm absorbancji, aby nie były one zniekształcone przez niepoprawnie dobrane parametry aparatury. W tym celu wykonano pomiary absorbancji w funkcji szerokości szczeliny światła padającego (.2, 1, 2 i 4nm). W przypadku pasma absorpcji S S 2, które jest pasmem bardzo wąskim spektralnie, dla szczeliny.2nm i 1nm nie obserwuje się różnicy w kształcie widma. Poszerzenie pasma absorpcji zaczyna być już widoczne dla szczeliny 2nm, a przy szczelinie 4nm dodatkowo można zaobserwować przesunięcie maksimum absorpcji pasma S S 2. W przypadku pasma absorpcji S S 1 nie obserwuje się aż tak wyraźnych zmian w jego kształcie, gdyż pasmo to nie jest tak wąskie spektralnie jak pasmo absorpcji związane z przejściem do stanu S ABS.4 ABS [nm].2,2nm 1nm 2nm 4nm [nm] Rys.3 Widma absorpcji S S 2 dla ZnTPP (c= mol/dm -3 ) w EtOH w funkcji szerokości szczeliny. Ze względu na duże różnice wartości molowych współczynników absorpcji przy wzbudzeniu do stanu S 2 i S 1 ( max (S 2 ) 25 max (S 1 )), w celu dokładnego zbadania widm absorpcji dla obu tych stanów koniecznym było zastosowanie kuwet o różnych długościach drogi optycznej. W ramach ustalenia odpowiednich parametrów dla pomiaru widm absorpcji zarówno w wybranym zakresie spektralnym (widm ciągłych ) 11

12 jak i dla wybranych długości fal (pomiarów punktowych ) opracowano również właściwą metodykę pomiaru. Jednym z ważnych czynników, jaki może wpływać na mierzony kształt widma absorpcji badanego związku jest różnica (z reguły niewielka) widm kuwetki pomiarowej i kuwetki odniesienia. Biorąc jednak pod uwagę oczekiwane nieznaczne różnice widm absorpcji dla monomeru i dimeru ZnTPP i ZnP, jak również brak danych odnośnie własności spektralnych stanu S 2 konieczne było wykonanie pomiarów absorpcyjnych z jak najmniejszym błędem wynikającym z niepowtarzalności pomiarów i z całkowitym wyeliminowaniem błędów systematycznych. Do pomiarów zastosowano kuwety absorpcyjne oraz emisyjne, wykonane z najwyższej jakości syntetycznego kwarcu (suprasil) o długości drogi optycznej: 5, 2, 1,.4,.2, oraz.1cm. Pomiar widm absorpcji (WA( )) oraz pomiar absorbancji dla wybranej długości fali (A( )) wykonano w spektrometrze dwuwiązkowym. Jednak każda kuwetka posiada swoje indywidualne widmo absorpcji, dlatego pomiary składały się z dwóch kroków: - krok pierwszy pomiar widma absorpcji kuwetki pomiarowej. Pomiar ten był wykonywany z udziałem użytego do badań rozpuszczalnika i tak np. dla ZnTPP w etanolu, najpierw wykonywano pomiar w dwóch kuwetach zawierających etanol, zarówno w torze pomiarowym jak i referencyjnym. - krok drugi pomiar widma absorpcji badanego związku. Po usunięciu z kuwety pomiarowej rozpuszczalnika, przepłukiwano ją wielokrotnie (5-1 krotnie) badanym roztworem (np. ZnTPP w etanolu), a następnie wykonywano właściwy pomiar widma absorpcji tego roztworu. Rzeczywiste widmo absorpcji badanego związku uzyskiwano poprzez wyeliminowanie wpływu różnicy kuwet próbki i odnośnika. W tym celu od eksperymentalnego widma absorpcji badanego związku (krok drugi) odejmowano widmo absorpcji kuwety pomiarowej zmierzone w kroku pierwszym. W przypadku bardzo dokładnych pomiarów punktowych absorbancji (niekiedy o bardzo małej wartości) poza koniecznością wyeliminowania wpływu nieidentyczności kuwety pomiarowej i odniesienia należało również wyeliminować wpływ niepowtarzalności pomiarów związany z wielokrotnym wkładaniem i wyjmowaniem kuwety pomiarowej ze spektrofotometru oraz zbadać stabilność pracy aparatury. W tym celu pomiar punktowy dla danej długości fali składał się z następujących kroków: 1) Krok pierwszy pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej: - pomiar absorbancji pustego, wyzerowanego na daną długość fali spektrofotometru, 12

13 - wielokrotny (najczęściej 3-krotny) pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik dla danej długości fali, - wyjęcie i ponowne włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej długości fali, - ponowne wyjęcie i włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej długości fali, - pomiar absorbancji pustego aparatu pomiarowego w celu kontroli stabilności jego pracy. 2) Krok drugi pomiar absorbancji badanego związku: - pomiar absorbancji pustego, wyzerowanego na daną długość fali spektrofotometru, - wielokrotny (najczęściej 3-krotny) pomiar absorbancji badanego związku dla danej długości fali, - wyjęcie i ponowne włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety zawierającej badany związek i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej długości fali - ponowne wyjęcie i włożenie do spektrofotometru w torze pomiarowym kuwety zawierającej badany związek i wielokrotny pomiar absorbancji dla danej długości fali - pomiar absorbancji pustego aparatu pomiarowego w celu kontroli stabilności jego pracy. Przykładowe pomiary absorbancji dla danej długości fali (pomiary punktowe) przedstawia Tabela 2. Tabela 2. Pomiary absorbancji ZnTPP w benzenie dla długości fali =417nm i szczeliny 4nm. (Końcowa wartość absorbancji A=,6214+,68=,6282). Krok pierwszy Krok drugi A średnia A średnia 1 Pomiar absorbancji pustego spektrofotometru,, 1 Pomiar absorbancji,,, pustego spektrofotometru,,, 13

14 2. Pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik 3. Ponowny pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik 4. Ponowny pomiar absorbancji kuwetki pomiarowej zawierającej rozpuszczalnik 5. Pomiar absorbancji pustego spektrofotometru -,68 -,68 2. Pomiar absorbancji,6214,6214 -,69 badanego związku,6214 -,68,6215 -,68 -,68 3. Ponowny pomiar,6216,6215 -,68 absorbancji badanego,6215 związku -,68,6215 -,69 -,68 4. Ponowny pomiar,6214,6214 -,68 absorbancji badanego,6214 związku -,68,6214,, 5. Pomiar absorbancji,,,1 pustego spektrofotometru,,, Pomimo iż spektrofotometry Cary-3 i V-55 cechują się dużą stabilnością pracy, zawsze w danym dniu pomiarowym, po czasie, w którym osiągnęły one pełną stabilność pracy, przed właściwymi pomiarami wykonywano najpierw pomiar linii zerowej (bazowej) spektrofotometru. Droga optyczna kuwet pomiarowych była dobierana tak, aby wartość absorbancji nie była większa niż 1. i nie była mniejsza niż.1. W takich warunkach błąd pomiaru absorbancji był najmniejszy. W spektrofotometrze V-55 obserwuje się czasami mimo poprawnej linii zerowej przekrzywienie widma absorbancji (patrz Dodatek) mierzonego związku efekt ten występuje tylko wtedy, gdy w torze pomiarowym znajduje się coś innego (np. kuweta z badana próbką) niż w torze referencyjnym, może być to efektem innego rozpraszania światła w torze pomiarowym i referencyjnym w wyniku: rysy, lub zabrudzenia na kuwecie pomiarowej, w badanym związku znajdują się nierozpuszczone fragmenty próbki, wytrąca się coś z roztworu, kuwety w torze pomiarowym i referencyjnym mogą być ustawione pod nieco innymi kątami w stosunku do wiązki światła wzbudzającego, 14

15 może to być problem związany z niestabilną pracą przyrządu, Przed pomiarem widm absorpcji należy odpowiednio dobrać takie parametry jak: szybkość skanowania, czas uśredniania wartości pomiarowych i odległość punktów pomiarowych (niestety producent w dostarczonym oprogramowaniu nie sprzągł tych parametrów ze sobą): czas uśredniania wartości pomiarowych jest to czas jaki potrzebuje urządzenie na zmierzenie jednego punktu pomiarowego. Jeśli ustawimy, że ma on wynosić np. 1 sekundę, to przez taki właśnie czas zbierany powinien być sygnał z fotopowielacza, odległość punktów pomiarowych jest to wartość kroku pomiarowego, czyli jak gęsto przyrząd ma dokonać pomiaru w funkcji długości fal. Załóżmy, że krok ten ustawiony został na.5 nm, szybkość skanowania ile nm na minutę ma rejestrować spektrofotometr, np. 1 nm/min, wszystkie trzy parametry są zależne od siebie, bo jeżeli punkt stawiany jest co.5 nm i w danym punkcie pomiar ma trwać 1 s, to szybkość skanowania nie może być większa niż 3 nm/min.5nm 1s.5nm 6 1s 6 3nm 6s jak podane zostało powyżej, 3nm/min, a nie wynosić 1 nm/min, poprzednie wyliczenia oparte były na prostym założeniu matematycznym, w trakcie testów wykonany został szereg pomiarów dla różnych parametrów i okazało się, że możliwe jest pewne odstępstwo od wyliczonych wartości, nie powodując przy tym błędów pomiarowych wymienionych poniżej. Tabela z możliwymi ustawieniami zamieszczona została w Dodatku, niedopasowanie tych parametrów, czyli ustawienie zbyt szybkiego skanowania, zbyt długiego czasu uśredniania, lub zbyt gęstego próbkowania, spowoduje zniekształcenie widma absorbancji nawet do tego stopnia, że zafałszowane zostanie położenie maksimum pasma, wartość absorbancji, a co za tym idzie kształt widma. 15

16 Metodyka pomiarów emisji Pomiar widm emisji Dla pomiarów stacjonarnych widm emisji 2 trudno przyporządkować jeden wspólny szablon z uwagi na różnorodność zastosowań tej metody badawczej. Poniżej wyszczególnione zostało kilka możliwości z uwzględnieniem procedury użytkowania spektrofluorymetru: włączenie urządzeń polega na: uruchomieniu spektrofluorymetrów, łącznie z włączeniem lampy, zasileniu fotopowielaczy, uruchomieniu chłodzenia fotopowielaczy pomiarowych, fotopowielacze są chłodzone z uwagi na zależność rejestrowanych ilości zliczeń od temperatury. Im niższa temperatura, tym szumy (tzw. prąd ciemny) są mniejsze, co znacznie poprawia jakość wyników i pozwala z większa dokładnością (dla mniejszych wartości) wykonywać pomiary wydajności kwantowych emisji, rozpoczęcie pomiarów może odbyć się dopiero po pewnym czasie od wykonanych powyżej czynności z uwagi na konieczność: schłodzenia się fotopowielaczy (zmniejszenia się tym samym wartości prądu ciemnego), ustabilizowania pracy fotopowielaczy, wygrzanie się lampy wzbudzającej, przystępując do właściwych badań należy wyznaczyć wartość prądu ciemnego, czy wykonać pomiar ilości zliczeń jakie mierzy detektor bez obecności światła wzbudzającego i próbki pomiarowej. Wartość ta jest ważna z uwagi na późniejsze pomniejszenie widm emisji o tą właśnie wartość, pomiary mające na celu wyznaczenie własności spektroskopowych, czyli np. wyznaczenie położenia maksimum pasma w widmie emisji, kształt widma emisji itp., należy wykonać pomiar widma emisji dla badanego związku pamiętając o: długość fali wzbudzenia podczas pomiaru widm emisji najlepiej ustawić 2 Stosowane na tym etapie wyrażenie widmo emisji odnosi się zarówno do widma emisji w klasycznym rozumieniu (stała, ustalona wartość długości fali wzbudzenia i zmieniana wartość długości fali emisji), jak i widma wzbudzenia emisji (stała ustalona wartość długości fali emisji i zmieniana wartość długości fali wzbudzenia). 16

17 w maksimum najbardziej długofalowego pasma absorpcji, a podczas pomiaru widma wzbudzenia emisji w maksimum pasma emisji, szczelina monochromatora wzbudzenia podczas pomiaru widm emisji może być dowolnie szeroka (należy uwzględnić szerokość pasma do którego wzbudzamy itp), a przy widmach wzbudzenia emisji możliwie wąska, szczelina monochromatora emisji powinna być ustawiona odwrotnie niż dla monochromatora wzbudzenia (widma emisji możliwie wąska, widma wzbudzenia emisji dowolnie szeroka), krok pomiaru powinien być wystarczająco mały celem dobrego odwzorowania kształtu widma, należy wykonać pomiar emisji dla rozpuszczalnika celem sprawdzenia jaki jest jego wkład w sumaryczne (widmo emisji badanego związku i rozpuszczalnika) widmo emisji zmierzone wcześniej. Pomiar ten musi być wykonany w dokładnie takich samych warunkach jak poprzedni, na etapie analizy (właściwa dla wszystkich widm emisji, niezależnie od użytego spektrofluorymetru SPF 5, MPF-3, TCSPC): od zmierzonych widm (wyznaczonych zgodnie z dwoma powyższymi punktami) odejmujemy zarejestrowaną wcześniej wartość średnią prądu ciemnego (szumu), przemnażamy widmo emisji rozpuszczalnika przez czynnik, który uwzględnia fakt, że dla próbki z badanym związkiem część światła wzbudzającego jest absorbowana (przez badany związek), a pozostała część jest rozpraszana. W przypadku próbki z samym rozpuszczalnikiem nic nie jest absorbowane (jeśli nie absorbuje rozpuszczalnik) i całe wzbudzające światło jest rozpraszane. Dlatego tez należy uwzględnić ten fakt (efekt jaki ma zostać uzyskany, ma doprowadzić do unormowania rozpraszania w samym rozpuszczalniku do wartości takiej jak w przypadku próbki z badanym związkiem) przemnażając widmo emisji rozpuszczalnika przez czynnik x określony wzorem: x ABS ABS( ( wzb ) wzb ) gdzie ABS(λ wzb ) oznacza wartość absorbancji dla długości fali wzbudzenia w kuwecie pomiarowej (w przypadku widm wzbudzenia 1 17

18 emisji każdy punkt takiego widma musi zostać przemnożony przez odpowiadający mu czynnik x z uwagi na zmieniającą się wartość absorbancji) odejmujemy od widma emisji badanego związku widmo emisji rozpuszczalnika przemnożone przez czynnik x. korygujemy wyznaczone w taki sposób widmo przez odpowiednią krzywą: korekcji emisji dla widm emisji, korekcji wzbudzenia emisji dla widm wzbudzenia emisji otrzymując końcowe widmo emisji, Wyznaczanie bezwzględnej wydajności kwantowej emisji (wykorzystanie standardu emisyjnego) wykonujemy pomiar absorbancji badanego związku dla długości fali wzbudzenia, przy której mierzone będą widma emisji, pamiętając o tym, żeby szczelina wzbudzenia na spektrofotometrze i na spektrofluorymetrze (na którym wykonywane będą pomiary widm emisji) była taka sama, wykonujemy pomiar widma emisji dla badanego związku pamiętając o: długość fali wzbudzenie wybieramy w dowolny, ale zaplanowany sposób, najczęściej w zakresie długofalowego pasma absorpcji badanego związku, tj. do stanu S 1, i tak aby nie absorbowal rozpuszczalnik, szczelina monochromatora emisji powinna być ustawiona na taką wartość, aby jakość otrzymanych widm była dobra, np. dla pomiaru widm emisji ze stanu S 1 dla porfiryn można stosować szczelinę 4 nm (w przypadku MPF-3), w tych samych warunkach wykonujemy pomiar widma emisji rozpuszczalnika, kolejnym koniecznym pomiarem do wykonania jest zmierzenie widma emisji standardu, najlepszym standardem byłby taki, który możemy wzbudzić tą samą długością fali co badany związek, a jego emisja leżałaby w tym samym zakresie co badanego związku, najczęściej stosowanym standardem emisyjnym jest siarczan chininy (QS) rozpuszczony w jedno normalnym wodnym roztworze kwasu siarkowego, którego wydajność kwantowa świecenia emisji wynosi.52 [[Birks_JRNBS(US)_8A_1976_389]] dla długości fali wzbudzenia w 18

19 zakresie nm. pomiar dla standardu emisyjnego wykonany powinien być dla takich samych parametrów pomiarowych, jak podczas mierzenia widma emisji badanego związku, wykonujemy pomiar widma emisji dla roztworu, w którym rozpuszczony jest standard emisyjny, analiza danych: odejmowanie szumu i rozpuszczalnika dla widm emisji badanego związku i standardu emisyjnego wykonujemy w taki sam sposób jak poprzednio, podstawiamy odpowiednie wartości pomiarowe do wzoru na wydajność kwantową emisji (2), otrzymuje się wartość bezwzględnej wydajności kwantowej emisji ( F ) dla badanego związku przy określonej długości fali wzbudzenia F st F I I em st em d d I I st ABS st ( ABS( wzb wzb gdzie indeks st oznacza wartości dla standardu, pierwszy człon określa pole pod krzywą widma emisji (niezależnie od tego czy widmo wykreślone jest w funkcji nanometrów, czy tez liczb falowych patrz Dodatek), drugi człon określa wartość intensywności wiązki wzbudzającej, trzeci wartość zaabsorbowanego światła, czwarty współczynniki załamania światła rozpuszczalnika i ostatni czynnik ) ) n n 2 st 2 aparaturowy (korygujący np. efekty polaryzacyjne). k 2 Wyznaczanie względnej wydajności kwantowej emisji sposób pomiaru podobny jak powyżej, ale nie stosuje się standardu emisyjnego, a uzyskane wyniki dla kilku próbek porównuje się do jednej wybranej próbki, taki sposób pomiaru stosuje się wówczas, gdy np.: stosuje się w pomiarach ten sam związek, ale zmienia jego stężenie, stosuje się różne dlugości fali wzbudzenia, zastosowanie standardu emisyjnego jest trudne do wykorzystania (inna długość fali wzbudzenia, inny zakres widma emisji). 19

20 Pomiar widma wzbudzenia emisji Widmo wzbudzenia emisji zazwyczaj mierzy się w celu porównania go z widmem absorptancji 3 próbki celem określenia czy zmierzone dla danej długości fali emisji widmo pochodzi tylko od badanego związku: wykonuje się pomiar widma wzbudzenia emisji badanego związku, aby uzyskać rzeczywisty kształt widma szerokość spektralna wiązki wzbudzającej nie powinna być większa niż 1/1 szerokości pasma do którego wzbudzamy w połowie wysokości. szczelina monochromatora emisji może być szeroka, np. 1 nm dla MPF-3, dobrać w odpowiedni sposób długość fali emisji zazwyczaj maksimum pasma emisji związku, wykonać pomiar widma wzbudzenia emisji dla rozpuszczalnika w tych samych warunkach co badanego związku, analiza danych: odejmowanie i korygowanie widm odbywa się dokładnie tak samo jak w przypadku widm emisji, z tym wyjątkiem, że czynnik x zmienia swoją wartość dla każdego punktu pomiarowego (inna wartość absorbancji dla każdej długości fali), porównanie widma wzbudzenia emisji z widmem absorptancji należy unormować widma w żądany sposób (np. w maksimum najbardziej długofalowego pasma absorpcji). Badania emisyjne, podobnie jak absorpcyjne, przedstawiono na przykładzie porfiryny ZnTPP. W celu zbadania widm fluorescencji ZnTPP w czterech stosowanych rozpuszczalnikach, dokonano szeregu pomiarów testowych. Ich zadaniem było określenie optymalnych warunków eksperymentalnych dla wykonania pomiarów emisyjnych. W pomiarach testowych ustalono jakie będą stosowane szerokości szczelin monochromatorów emisji i wzbudzenia, jaki będzie krok pomiarowy i czas integracji (czas zliczania w jednym punkcie pomiarowym), przeprowadzono kalibrację monochromatorów emisji i wzbudzenia, dobrano rodzaj kuwet pomiarowych (ze 3 Widmo absorptancji jest to widmo otrzymane po przeliczeniu każdego punktu pomiarowego z widma absorbancji za pomocą wyrażenia: 1 1 ABS 2

21 względu na długość drogi optycznej promieniowania padającego i emitowanego) oraz wyeliminowano wpływ efektów polaryzacyjnych na badane widma emisji. W pierwszej kolejności wykonano pomiary, które pozwoliły ustalić właściwy dobór szerokości szczelin monochromatorów wzbudzenia i emisji. Było to warunkiem koniecznym do wykonania pomiaru rzeczywistych widm emisji i wzbudzenia emisji, a także wyznaczenia poprawnych wartości wydajności kwantowych emisji, obarczonych jak najmniejszym błędem. Istotnym problemem w badaniach emisyjnych porfiryn są ich bardzo wąskie pasma absorpcji i emisji związane z przejściami między stanami S i S 1 jak i S i S 2. Ta cecha badanych w pracy związków zmusza do stosowania wąskich szczelin emisji w pomiarze rzeczywistych widm emisji. W badaniach testujących zastosowano szczeliny emisji em=2nm i 4nm. Aby uzyskać wystarczająco intensywne widmo emisji należało użyć szerokiej szczeliny wzbudzenia wzb=(2-4)nm. Zmierzone widma (Rys.4) mają taki sam kształt przy obu szczelinach emisji, dlatego we właściwych badaniach stosowano szczelinę emisji 4nm, zapewniając znacznie lepszą jakość mierzonego widma. Dla porównania zastosowana szeroka szczelina emisji ( em=2nm) powodowała wyraźne zniekształcenie mierzonego widma. W przypadkach, gdy celem pomiarów było bardzo dokładne wyznaczenie położenie maksimów pasm emisji, w szczególności przy wyznaczaniu przesunięcia Stokesa, pomiary wykonywano na układzie SPC stosując em.9nm [nm] 745 I em [j.u.] em 2nm; wzb = 2nm em = 2nm; wzb = 3nm em = 2nm; wzb = 4nm em = 4nm; wzb = 2nm em = 4nm; wzb = 3nm em = 4nm; wzb = 4nm em = 2nm; wzb = 4nm SPC, em =.9nm; wzb <1nm [cm -1 ] 21

22 Rys.4. Unormowane widma fluorescencji S 1 S ZnTPP (c= mol/dm 3 ) w benzenie dla wzb=417nm, w funkcji szerokości szczeliny wzbudzenia i emisji. W badaniach, których celem było wyznaczenie F(S 1 ) starano się tak dobrać parametry pomiarowe, aby szczelina wzbudzenia była jak najmniejsza i taka sama jak w pomiarze absorbancji na spektrofotometrze Cary-3. Było to konieczne aby wyznaczone z pomiarów absorpcyjnych wartości absorptancji ( I 1 1 wzb ) były zgodne z rzeczywistymi wartościami I abs w pomiarach widm emisji. W pomiarach tych szczeliny monochromatora wzbudzenia wynosiły wzb=2nm i wzb=4nm (Rys.5). Uzyskane widma emisji S S 1 ZnTPP w EtOH w przypadku obu użytych szczelin wzbudzenia nie różnią się kształtem, jednak zmniejszenie szczeliny wzb z 4nm do 2nm powoduje około sześciokrotne zmniejszenie intensywności fluorescencji. Znacznie utrudnia to ilościowe pomiary emisyjne w przypadku próbek o małym stężeniu i przy wzbudzeniu na długofalowym zboczu pasma Soreta, kiedy to uzyskuje się najmniejszy sygnał emisji. Tymczasem bardzo dokładne wyznaczenie F(S 1 ) właśnie w tych warunkach wzbudzenia było jednym z najważniejszych celów pracy. W związku z tym ustalono, że we wszystkich pomiarach widm emisji, wykonanych w celu wyznaczenia F(S 1 ) dla ZnTPP będą stosowane szczeliny wzb=4nm (dla monochromatora wzbudzenia) i em=2nm (dla monochromatora emisji). abs A 22

23 [nm] A wzb=2nm wzb=4nm I em [j.u.] [cm -1 ] [nm] B wzb=2nm wzb=4nm I em [j.u.] [cm -1 ] Rys.5. Rzeczywiste (A) i unormowane (B) widma fluorescencji S 1 S ZnTPP (c= mol/dm 3 ) w etanolu dla wzb=415nm, w funkcji szerokości szczeliny wzbudzenia, em=1nm. W celu pomiaru poprawnych widm wzbudzenia fluorescencji badanych porfiryn i ich ilościowego porównania z widmami absorptancji (wyznaczonymi z pomiarów widm absorpcji) stosowano takie same wąskie szczeliny wzbudzenia, wzb=(2-4)nm. 23

24 W drugiej kolejności wykonano szereg pomiarów, których celem był taki dobór warunków eksperymentalnych, aby widma fluorescencji i widma wzbudzenia fluorescencji były nie tylko poprawnie zmierzone, ale aby powtarzalność i wiarygodność pomiarów była jak największa. Gwarantowało to możliwie najmniejsze błędy przy wyznaczaniu maksimów pasm emisji, wartości wydajności kwantowych fluorescencji oraz badanie wpływu stężenia porfiryny na kształt i położenie widm fluorescencji i widm wzbudzenia fluorescencji. W tym celu wykonano pomiary widm wzbudzenia emisji antracenu w etanolu, charakteryzującego się podobnie jak porfiryny, wąskimi pasmami absorpcji i emisji. Pomiary te pozwoliły ustalić optymalny czas integracji (czas zliczania w danym punkcie pomiarowym ilości wyemitowanych przez próbkę kwantów światła) oraz krok pomiarowy, określający częstotliwość próbkowania. Rys.6 przedstawia całą serię wielokrotnych pomiarów wykonanych dla czasu integracji 3ms i 1ms oraz kroku pomiarowego.1,.3 i 1.nm. Dla wszystkich tych parametrów widma wzbudzenia fluorescencji zostały zmierzone trzykrotnie (cyfry (1), (2) i (3) oznaczają kolejny pomiar). Łatwo można zauważyć, że najdokładniejsze widma uzyskuje się dla parametrów 1ms/.1nm, ale zarazem całkowity czas rejestracji całego widma przy takich ustawieniach znacznie się wydłuża (Rys.7). Ustalono, że najkorzystniejszymi parametrami do badań emisyjnych ZnTPP będzie czas integracji 3ms i krok pomiarowy co.1nm. Przy takich ustawieniach spektrofluorymetru MPF-3 uzyskuje się widma emisji i widma wzbudzenia fluorescencji o dużej wartości sygnału i bardzo dobrej powtarzalności oraz stosunkowo niedługim czasie rejestracji całego widma. 24

25 [nm] 4 2 A [nm] 4 2 B ms/.1nm (1) 3ms/.1nm (2) 3ms/.1nm (3) ms/.3nm (1) 3ms/.3nm (2) 3ms/.3nm (3) [cm -1 ] [cm -1 ] [nm] 4 2 E 15 I em [j.u.] I em [j.u.] I em [j.u.] [nm] 4 2 C [nm] 4 2 D I em [j.u.] I em [j.u.] ms/.1nm (1) 1ms/.1nm (2) 1ms/.1nm (3) 27 1ms/.3nm (1) 1ms/.3nm (2) 1ms/.3nm (3) [cm -1 ] [cm -1 ] ms/1nm (1) 1ms/1nm (2) 1ms/1nm (3) 27 [cm -1 ] 255 Rys.6. Widma wzbudzenia fluorescencji antracenu w etanolu (c~1-5 mol/dm 3 ) w funkcji czasu integracji (A, B 3ms; C, D, E 1ms) i kroku pomiarowego (.1,.3 i 1nm); em=421nm, wzb=4nm, em=1nm. 25

26 [nm] I em [j.u.] 1 5 3ms/.1nm 1 (czas pomiaru ok 3 min) 3ms/.3nm 1 (czas pomiaru ok 1min) 1ms/.1nm 1 (czas pomiaru ok 1 min) 1ms/.3nm 1 (czas pomiaru ok 3.5 min) 1ms/1nm 1 (czas pomiaru ok 1 min) [cm -1 ] Rys.7. Widma wzbudzenia fluorescencji antracenu w etanolu (c~1-5 mol/dm 3 ) w funkcji czasu integracji i kroku pomiarowego; em=421nm, wzb=4nm, em=1nm. 25 Ze względu na bardzo wąskie pasma emisji i wzbudzenia emisji porfiryn bardzo ważnym zadaniem była dokładna kalibracja monochromatorów wzbudzenia i emisji spektrofluorymetru MPF-3. Kalibrację monochromatora wzbudzenia przeprowadzono za pomocą porównania kilku widm wzbudzenia fluorescencji z widmami absorptancji (I abs ) antracenu w etanolu. Widma absorpcji zmierzono na spektrofotometrze Cary-3 lub V-55 używając szerokości szczeliny 2nm i 4nm, oraz krok pomiarowy co.1nm, natomiast widma wzbudzenia fluorescencji zmierzono odpowiednio dla wzb=2nm i 4nm oraz em=1nm. Otrzymaną różnicę w położeniach pasm (,1) pomiędzy widmami absorptancji i wzbudzenia emisji, wynoszącą -1nm uznano za wartość o jaką należy zawsze skorygować ustawienia monochromatora wzbudzenia. Kalibrację monochromatora emisji przeprowadzono ustawiając monochromator wzbudzenia na daną długość fali, np. 54nm, a następnie przesuwając monochromator emisji w okolicach tej samej wartości 54nm i wyznaczano długość fali dla której ilość emitowanych przez próbkę kwantów promieniowania będzie największa. Pomiary takie wykonano dla kilku różnych długości fal. W ten sposób, znając poprawne wskazania monochromatora wzbudzenia można było wyznaczyć poprawkę, którą trzeba uwzględnić przy określaniu rzeczywistego położenia monochromatora emisji. 26

27 Stwierdzono, że ustawienia monochromatora emisji należy zawsze korygować o wartość -5nm. Kolejnym ważnym krokiem w opracowaniu metodyki pomiarów emisyjnych było przeprowadzenie badań dotyczących wpływu kształtu i rozmiaru kuwet oraz ich ustawienia, na widma fluorescencji badanych związków. Konieczność przeprowadzenia tych badań wynikała przede wszystkim z bardzo silnego nakładania się widma absorpcji i fluorescencji w zakresie pasma Soreta, a w rezultacie znacznej reabsorpcji emitowanego promieniowania. Do pomiarów używano najczęściej kuwet o długości drogi optycznej 1x.4cm, jak również 1x.2cm, 1x.1cm oraz.3x.3cm i.15x.15cm. Geometria pomiarów wyglądała następująco: wzbudzenie wzbudzenie emisja emisja.4cm 1cm,15cm 1cm (a) (b) Rys.8. Geometria pomiarów emisyjnych Kuweta pomiarowa była ustawiona tak (Rys.8(a)), że wzbudzenie następowało w warstwie cieńszej, czyli w przypadku podanego wyżej wykresu wzbudzenie następowało przez warstwę roztworu o grubości.4cm. Takie ustawienia kuwety pomiarowej zapewnia uzyskanie maksymalnej intensywności świecenia próbki. Dla porównania w kuwecie 1x1cm intensywność emisji (I em ) jest 2.3 razy mniejsza (dla typowych szczelin emisji stosowanych w tej pracy) niż w kuwecie o geometrii przedstawionej na Rys.8(a). Natomiast użycie kuwety pomiarowej o małych rozmiarach, tj., mikrokuwety (Rys.8(b)) zapewnia zmniejszenie reabsorpcji emitowanego promieniowania. Intensywność emisji w tej kuwecie jest jednak znacznie mniejsza niż w kuwetach o rozmiarach 1..4, ponieważ tylko część promieniowania 27

28 wychodzącego z monochromatora wzbudzenia pada na próbkę znajdującą się w mikrokuwecie. Zjawisko reabsorpcji występuje w przypadku wielu związków, dla których długofalowe pasmo w widmie absorpcji nakłada się (przynajmniej częściowo) na ich widmo emisji. W przypadku porfiryn bardzo znaczna reabsorpcja jest związana z silnym nakładaniem się na siebie bardzo blisko leżących pasm absorpcji S S 2 i fluorescencji S 2 S. Efekt ten powoduje znaczne zniekształcenie widma emisji w zakresie krótkofalowym (jest on największy dla maksimum pasma absorpcji), zmianę kształtu widma fluorescencji, a także błędne wyznaczenie zarówno przesunięcia Stokesa S2, (A-F) jak i obniżenie mierzonej wydajności kwantowej fluorescencji ze stanu S 2. W przypadku fluorescencji ze stanu S 1 nie ma specjalnego kłopotu z wyeliminowaniem reabsorpcji fluorescencji, gdyż ze względu na stosunkowo dużą wartość F(S 1 ) można badać próbki o wystarczająco małej absorpcji. Kształt widma fluorescencji S 1 S, a także położenie maksimum i jego intensywność nie ulega zmianie w przypadku pasma (,1) dla kuwet o różnych długościach drogi optycznej w torze emisji (Rys.9). Obserwuje się niewielkie obniżenie intensywności fluorescencji w maksimum pasma (,) dla kuwety.4 1cm, będące wynikiem reabsorpcji emisji w tej kuwecie. [nm] kuweta.4/1 cm kuweta.3/.3 cm (,1).8 wzb=1nm; em=1nm (,).6 I em [j.u.] [cm -1 ] Rys.9. Unormowane widma fluorescencji S 1 S ZnTPP (c = mol/dm 3 ) w etanolu dla wzb=4nm, zmierzone w kuwetach o różnych drogach optycznych l=.4/1cm,.3/.3cm. 28

29 W celu wyznaczenia dla badanych porfiryn wartości F(S 1 ) z jak najmniejszym błędem wykonano wiele pomiarów intensywności padającego promieniowania I dla tych wzb, które stosowano przy wyznaczaniu F(S 1 ). Uśrednione wyniki tych pomiarów przedstawiono w Tabeli 3. Zamieszczone dane zmierzono w kilku seriach (od 5 do 1), a każda z nich składała się z 1-krotnego zliczania impulsów w jednym punkcie pomiarowym z czasem integracji 1ms/punkt. Umożliwiło to precyzyjne wyznaczenie względnych wartości intensywności I dla stosowanych w pracy wzb. Tabela 3. Wartości intensywności I dla wybranych długości fal wzbudzenia. [nm] I I 359 λ I 1,,83,81,83,83,79,87 I I 359 λ I 1,,8,84,82 I I 359 λ I 1,,8,85,82 I I 359 λ I 1,,81,8,8,84,86,86 I I 359 λ I 1,,84,82,8,83,83 I

30 I 359 λ I 1,,84,82,85,85,84,8,88 I I 359 λ I średnia: I 359 I λ 1,,85,81,78,82 1,,85,82,79,83,83,8,81,84,85,84,82,8,87 Wydajności kwantowe fluorescencji F porfiryn zostały wyznaczone metodą względną, w oparciu o porównanie intensywności emisji badanej próbki z intensywnością emisji wzorca. Jako wzorzec stosowano roztwór siarczanu chininy w,1 mol dm -3 wodnym roztworze kwasu siarkowego ( F st =,52). Wydajność kwantową fluorescencji porfiryn wyznaczano ze wzoru: I d I (1 1 ) n st A st 2 st em F F F st A 2 st k I I (1 1 ) ( n ) emd (5) gdzie: A absorbancja roztworu dla długości fali, którą wzbudzano próbkę I em intensywność emisji w funkcji jej częstotliwości n współczynnik załamania światła rozpuszczalnika, I intensywność promieniowania padającego na próbkę F k czynnik korygujący związany z użyciem innego wzb dla badanego związku i dla standardu. st indeks informujący o tym, że dana wielkość odnosi się do wzorca (standardu) Ważnym zadaniem w opracowaniu pełnej metodyki badań emisyjnych było wyznaczenie czynnika (F k ) korygującego efekty polaryzacyjne. Odgrywają one istotną rolę w pomiarach widm wzbudzenia fluorescencji i przy badaniu wpływu wzb na wartości F(S 1 ). Konieczność wprowadzenia tej korekcji spektrofluorymetru wynika z tego, że promieniowanie emitowane przez próbkę, które dochodzi do detektora emisji (F1) przebywa inną drogę optyczną (w tym przez monochromator emisji) aniżeli promieniowanie padające na próbkę, którego intensywność (I ) jest mierzona przez 3

31 licznik kwantów (F2), który znajduje się bezpośrednio przed nią. W związku z powyższym przeprowadzono szereg pomiarów widm wzbudzenia emisji roztworu Rodaminy B w glikolu etylenowym, w takiej samej kuwecie pomiarowej (trójkątnej) i o takim samym stężeniu jak Rodamina B używana w spektrofluorymetrze MPF-3 jako licznik kwantów. Różnice dróg optycznych promieniowania padającego na próbkę i emitowanego przez nią są odpowiedzialne za wyznaczone krzywe korekcji (Rys.1). Krzywe te wykorzystano do poprawnego wyznaczenia widm wzbudzenia emisji i wartości wydajności kwantowych emisji badanych związków [nm] średnia 8 I em [j.u.] [cm -1 ] 22 2 Rys.1 Krzywa korekcji efektów polaryzacyjnych otrzymana przy pomiarze widma wzbudzenia emisji Rodaminy B mierzonego w trójkątnej kuwecie, dla em=62nm. 18 W Tabeli 4 zamieszczono przykładowe wartości współczynnika korygującego efekty polaryzacyjne dla wybranych wzb, najczęściej stosowanych w pracy przy wyznaczaniu wartości F(S 1 ). Wartości te zostały odniesione do długości fali =359nm, którą używano do wzbudzania siarczanu chininy, stosowanego w pracy jako standard. 31

32 Tabela 4. Wartości współczynnika korygującego efekty polaryzacyjne (F k ) dla wybranych długości fal. F k I 359 em [nm] I I em [j.u.] 1 F k I em [j.u.] 2 F k I em [j.u.] 3 F k średnie F k ,96 1, 6,56 1, 66,55 1, 1, 415 9,78,9 68,49,88 74,12,9, ,91,9 66,68,91 74,12,9, ,9,9 68,89,88 74,1,9, ,7,9 69,6,88 73,83,9, ,34,91 69,6,88 73,59,9, ,11,91 68,96,88 73,46,91, ,19,92 68,2,89 73,3,91, ,21,93 67,43,9 72,66,92, ,17,94 66,5,91 72,5,92, ,75,96 65,43,93 71,,94, ,6,98 64,18,94 69,46,96, ,13 1,2 61,15,99 65,49 1,2 1, ,9 1,24 49,36 1,23 52,88 1,26 1, ,88 1,24 49,47 1,22 52,91 1,26 1, ,42 1,31 47,64 1,27 49,92 1,33 1,31 x em ; ; ;