Zmiany epigenetyczne, w tym metylacja DNA, wpływają na strukturę chromatyny, ekspresję

Transkrypt

1 Znaczenie metylacji DNA profilu epigenetycznego komórek jelita grubego w ich transformacji nowotworowej Streszczenie Zmiany epigenetyczne, w tym metylacja DNA, wpływają na strukturę chromatyny, ekspresję genów i stabilność genomu. Zaburzenia wzoru metylacji DNA mogą mieć znaczenie dla stanów patologicznych, w tym raka jelita grubego. Najczęściej występującym szlakiem prowadzącym do tego nowotworu jest sekwencja gruczolak-gruczolakorak. Wyniki badań sugerują, że podczas tego procesu zachodzą zmiany we wzorze metylacji DNA, jednakże nie wiadomo czy zmiany te należą do przyczyn transformacji nowotworowej komórek jelita grubego, czy są konsekwencją zmian patologicznych w komórkach nowotworowych. Zatem, zmiany wzoru metylacji DNA mogą odgrywać rolę w transformacji nowotworowej komórek jelita grubego, jednak hipoteza ta nie została potwierdzona eksperymentalnie i istnieje potrzeba prowadzenia badań nad ustaleniem zależności pomiędzy zaburzeniami metylacji DNA, a rakiem jelita grubego. Dzięki analizie metylacji sekwencji DNA wyodrębniono molekularną podgrupę tego nowotworu, cechującą się wysoką częstością metylacji genów, nazwaną fenotypem metylatora wysp CpG (CIMP). Zmiany we wzorze metylacji DNA znalazły zastosowanie jako molekularne wyznaczniki dla celów diagnostycznych i badań przesiewowych raka jelita grubego. Lepsze zrozumienie zaburzeń metylacji DNA w transformacji nowotworowej komórek jelita grubego może przyczynić się do ułatwienia prognozowania i predykcji tej choroby oraz do podniesienia efektywności badań diagnostycznych. WPROWADZENIE Rak jelita grubego (CRC, ang. colorectal cancer) jest jedną z najczęściej występujących chorób nowotworowych i przyczyniającą się do wysokiej liczby zgonów. W 2008 roku na świecie zanotowano ponad 1,2 mln zachorowań na CRC oraz ponad 0,6 mln zgonów z powodu tej choroby, przy czym obserwuje się tendencję do większej zachorowalności w krajach rozwiniętych niż w krajach rozwijających się [1]. Transformacja nowotworowa w raku jelita grubego jest wypadkową czynników środowiskowych, genetycznych i epigenetycznych, które prowadzą do przekształcenia prawidłowych komórek nabłonkowych jelita grubego do komórek nowotworowych. Wzór epigenetyczny jest cechą dziedziczną, która może wpływać na ekspresję genów, ale nie jest zmianą w sekwencji DNA. Wśród mechanizmów epigenetycznych wyróżnia się metylację DNA. Zmiany we wzorze metylacji DNA obserwuje się podczas inicjacji, promocji oraz progresji CRC. Paulina Tokarz * Janusz Błasiak Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź * Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, ul. Pomorska 141/143, Łódź; tel./faks: (42) , ptokarz@biol. uni.lodz.pl Artykuł otrzymano 23 kwietnia 2013 r. Artykuł zaakceptowano 21 czerwca 2013 r. Słowa kluczowe: fenotyp metylatora wysp CpG, gruczolak, gruczolakorak, metylacja DNA, rak jelita grubego, transformacja nowotworowa, zmiany epigenetyczne Wykaz skrótów: 5mC 5-metylocytozyna; CIMP fenotyp metylatora wysp CpG; CIN niestabilność chromosomowa; CRC rak jelita grubego; DNMT metylotransferaza DNA; EMT przejście nabłonkowo-mezenchymalne; MET przejście mezenchymalno- -nabłonkowe; MSI niestabilność mikrosatelitarna; SAM S-adenozylo-L-metionina; TDG glikozylaza DNA tyminy METYLACJA W WYSPACH CpG U ssaków metylacja DNA dotyczy głównie cytozyny poprzez enzymatyczne przeniesienie grupy metylowej z S-adenozylo-L-metioniny (SAM) na węgiel w pozycji 5, tworząc 5-metylocytozynę (5mC) [2] (Ryc. 1). Modyfikacja ta nie wpływa na parowanie zasad azotowych w DNA. Grupa metylowa znajduje się w dużym rowku DNA, gdzie może oddziaływać z białkami. W komórkach człowieka 5mC stanowi około 1% wszystkich zasad azotowych [3]. Jej niska częstość występowania jest związana z jej promutagennym charakterem. Ulega ona spontanicznej deaminacji tworząc tyminę, co w konsekwencji może prowadzić do mutacji typu tranzycji [4] (Ryc. 2). Dla porównania, konwersja niezmetylowanej cytozyny do uracylu zachodzi 4 razy wolniej. Ponadto, naprawa błędnego sparowania zasad G-T zachodzi mniej wydajnie od naprawy G-U, ponieważ glikozylaza DNA tyminy (TDG) działa mniej efektywnie od glikozylazy DNA uracylu [5]. Cytozyny ulegające metylacji występują najczęściej w dinukleotydach CpG oraz trinukleotydach CpT/C/ApG. Sekwencje CpG są nierównomiernie rozmieszczone w genomie i występują w regionach długich sekwencji powtarzających się, w tym w centromerach, retrotranspozonach czy rdna, a także tworzą skupiska w krótkich odcinkach DNA, nazywanych wyspami CpG [6,7]. Cytozyny w wyspach CpG są chronione przed metylacją dzięki zawadom sterycznym w postaci białek wiążących się ze specyficznymi sekwencjami DNA lub dzięki pozycjonowaniu nukleosomów, blokując dostęp metylotransferaz DNA [8,9]. Natomiast 80% cytozyn w dinukleotydach CpG występujących poza Postępy Biochemii 59 (3)

2 dinukleotydów CpG wynoszącym co najmniej 0,6 [11]. Stosunek ten jest definiowany jako [11]: Obserwowane CpG liczba CpG = N Oczekiwane CpG liczba G liczba C Rycina 1. Metylacja DNA katalizowana przez metylotransferazę DNA (DNMT): przeniesienie grupy metylowej z S-adenolyno-L-metioniny (SAM) na węgiel w pozycji 5 cytozyny z utworzeniem 5-metylocytozyny (5mC) i uwolnieniem S-adenozyno-L-homocysteiny (SAH). Grupa metylowa 5mC znajduje się w dużym rowku DNA nie wpływając na parowanie zasad w DNA. obszarem wysp CpG, w sekwencjach powtarzających się, reprezentowanych przez sekwencje niekodujące oraz przez transpozony, pozostaje zmetylowana [7,10]. Brak jest jednoznaczności w określeniu wyspy CpG, jednakże można przyjąć, że wyspa CpG to odcinek DNA długości co najmniej 200 pz, charakteryzujący się zawartością par CG powyżej 50% oraz stosunkiem liczby obserwowanych do oczekiwanych gdzie N liczba nukleotydów w sekwencji. Największe rozbieżności w określeniu wyspy CpG dotyczą jej długości w niektórych danych literaturowych przyjmuje się długość powyżej 500 pz. Wyspy CpG przeważnie znajdują się po stronie 5 genu i występują w około 60% sekwencji promotorowych, w tym w prawie wszystkich sekwencjach promotorowych genów metabolizmu podstawowego oraz części genów specyficznych tkankowo [12]. Wyspy CpG znajdujące się w regionie 5 genów metabolizmu podstawowego pozostają zwykle niezmetylowane, za wyjątkiem genów jednego z chromosomów X u kobiet, genów podlegających piętnowaniu rodzicielskiemu, czy niektórych genów homeotycznych, które są metylowane w trakcie embriogenezy [6]. Metylacja cytozyny w wyspach CpG położonych w regionach promotorowych może wyciszać ekspresję genów na poziomie transkrypcji. Wyciszanie ekspresji genów po- Rycina 2. Naprawa skutków demetylacji cytozyny i 5-metylocytozyny w DNA. Uracyl powstały poprzez deaminację cytozyny jest usuwany przez glikozylazę DNA uracylu (UDG). Deaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania tyminy, która jest usuwana przez glikozylazę DNA tyminy (TDG). Długość strzałek reprezentuje efektywność procesów. Jeśli zasady, które uległy deaminacji nie zostaną naprawione może dojść do utrwalenia uszkodzenia podczas replikacji

3 przez metylację DNA może zachodzić na dwa sposoby. Pierwszy, poprzez utratę powinowactwa czynników transkrypcyjnych, np. AP-2, CREB, E2F czy NF-ĸB, do zmetylowanych sekwencji DNA z uwagi na zawadę steryczną jaką stanowi grupa metylowa [13]. Drugi, poprzez przyłączanie represorów zawierających domeny wiążące grupy metylowe (MBP), a następnie przyłączanie deacetylaz histonowych, co indukuje kondensację chromatyny. MBP obejmują MeCP2, MBD1, MBD2 oraz MBD4, białka zawierające motyw palca cynkowego Kaiso, ZBTB4 oraz ZBTB38; białka zawierające domeny SET oraz domeny palca RING, UHRF1 oraz UHRF2 jak również inne białka [14,15]. Enzymami przeprowadzającymi metylację oraz demetylację DNA są odpowiednio metylotransferazy i demetylazy [16]. W komórkach ssaków dwie niezależne metylotransferazy DNMT3A i DNMT3B przeprowadzają metylację de novo i wykazują takie samo powinowactwo do niezmetylowanego oraz do hemimetylowanego DNA [17,18]. Z kolei rolą DNMT1 jest utrzymanie statusu metylacji DNA poprzez odtworzenie wzoru metylacji po replikacji DNA na nici potomnej w hemimetylowanym DNA [2,19]. Sygnałem dla DNMT1 do metylacji DNA jest brak symetryczności metylacji dinukleotydów CpG położonych naprzeciw siebie na nici matczynej i nici potomnej w cząsteczce DNA. Wzór symetrycznej metylacji na obu niciach DNA zapobiega ekspresji genów na każdej z nici. DNMT1 działa głównie w fazie S cyklu komórkowego, kiedy białko to znajduje się w widełkach replikacyjnych [20]. Gdy aktywność DNMT1 jest zahamowana podczas podziałów komórkowych, dochodzi do pasywnej demetylacji DNA. METYLACJA A SEKWENCJA GRUCZOLAK- GRUCZOLAKORAK Związek pomiędzy zmianami epigenetycznymi a procesem nowotworzenia został udokumentowany, kiedy wykazano globalną utratę 5mC w komórkach nowotworowych w porównaniu do komórek prawidłowych [21]. Globalna utrata metylacji DNA, hipometylacja, zachodzi głównie w sekwencjach powtarzających się, ma miejsce na wczesnych etapach transformacji nowotworowej, jak również zwiększa się wraz z wiekiem [22-25]. Po odkryciu związku pomiędzy globalną hipometylacją a nowotworzeniem zauważono zmianę wzoru metylacji DNA, gdzie zwykle niezmetylowane sekwencje promotorowe genów wykazywały hipermetylację [22]. Badania genomu pokazały, że około 1-10% wysp CpG jest zmetylowanych nieprawidłowo w komórkach nowotworowych [25]. Hipermetylacja sekwencji promotorowych genu zwykle jest związana z jego wyciszeniem transkrypcyjnym oraz z brakiem mutacji w sekwencji kodującej tego genu. Na tej podstawie wysunięto hipotezę o wyciszeniu genów na poziomie transkrypcji poprzez hipermetylację DNA jako alternatywnym mechanizmie nowotworzenia [26]. Badania dotyczące hipermetylacji uznanych genów supresorowych, p16, CDH1 czy MLH1, przedstawiły pośrednią zależność pomiędzy nieprawidłową hipermetylacją DNA a transformacją nowotworową [27-29]. Stwierdzono, że w ponad 100 genach wzór metylacji sekwencji promotorowych ulega zaburzeniu podczas indukcji, progresji i promocji CRC [30]. Liczba genów, w których występuje nieprawidłowa metylacja DNA jest większa od liczby genów z mutacjami w CRC i stale rośnie. W CRC obserwuje się globalną hipometylację oraz lokalną hipermetylację DNA (Ryc. 3). Hipometylacja DNA jest związana z włączeniem lub podwyższeniem poziomu ekspresji genu. Modyfikacji tej ulegają sekwencje powtarzające się, w tym transpozony, co prowadzi do zwiększenia niestabilności genomowej poprzez promowanie rearanżacji chromosomów. Dodatkowo, hipometylacja DNA może prowadzić do aktywacji onkogenów oraz do utraty piętnowania rodzicielskiego. Jednym z mechanizmów prowadzących do hipometylacji DNA jest nieprawidłowa funkcja DNMT1 i w efekcie pasywna demetylacja podczas replikacji. Z kolei, hipermetylacji są poddane geny supresorowe, których produkty koordynują proce- Rycina 3. Zmiana wzoru metylacji DNA w wyspach CpG w sekwencjach promotorowych genów istotnych dla transformacji raka jelita grubego. Wyspy CpG w sekwencjach promotorowych onkogenów oraz genów ulegających piętnowaniu rodzicielskiemu w prawidłowych komórkach pozostają hipermetylowane i nieaktywne transkrypcyjnie (A). W czasie nowotworzenia dochodzi do demetylacji tych sekwencji i syntezy produktów ich genów. Większość wysp CpG w prawidłowych komórkach błony śluzowej jelita grubego w sekwencji promotorowej genów jest niezmetylowana (B). Geny, w tym geny supresorowe, których wyspy CpG są niezmetylowane, ulegają ekspresji. Podczas onkogenezy wyspy CpG tych genów ulegają hipermetylacji prowadząc do zahamowania transkrypcji tych genów. Postępy Biochemii 59 (3)

4 sy komórkowe jak naprawę DNA, cykl komórkowy, apoptozę, adhezję komórkową czy angiogenezę. Hipermetylacja sekwencji promotorowej genu prowadzi do represji jego ekspresji na poziomie transkrypcji. Dodatkowo hipermetylacja DNA może pośrednio hamować transkrypcję genów poprzez wyciszanie ekspresji czynników transkrypcyjnych, jak również może stymulować mutację typu tranzycji C>T dzięki spontanicznej deaminacji 5mC. Hipermetylacja DNA może również prowadzić do utrzymania stanu niezróżnicowania nowotworowych komórek macierzystych, podwyższając złośliwość guza [31]. Zmiana statusu metylacji DNA w wyspach CpG jest jednym z zaburzeń prowadzących do transformacji nowotworowej. Zatem hipoteza dwóch uderzeń Knudsona mówiąca o znaczeniu dwóch mutacji w allelach tego samego genu dla kancerogenezy wymaga uzupełnienia o zmiany epigenetyczne [32]. Wykazano, że część CRC powstaje na podłożu epigenetycznym, przy czym wyciszone są geny związane zarówno ze szlakiem mutacyjnym gruczolak-gruczolakorak Fearona i Vogelsteina, jak i geny związane z niestabilnością mikrosatelitarną [33,34]. Najczęściej obserwuje się zmiany epigenetyczne genów MLH1, p16 oraz MGMT [35]. Hipermetylacja MLH1, genu kodującego białko systemu naprawy błędnie sparowanych nukleotydów MMR, powoduje defekty w funkcjonowaniu tej naprawy i wzrost liczby mutacji [36]. Szczególnie narażone na mutacje są sekwencje mikrosatelitarne [37]. Zwykle są one stabilne, lecz poślizg polimerazy DNA w tych miejscach prowadzi do insercji bądź delecji, a zatem zmiany otwartej ramki odczytu. Jeśli zmiany te zostaną utrwalone mogą skutkować niestabilnością mikrosatelitarną (MSI). Do 20% przypadków CRC może wykazywać MSI, które jest spowodowane przez inaktywację genów kodujących białka naprawy MMR [29]. Inaktywacja ta rzadko jest spowodowana mutacją tych genów, częściej mechanizmami epigenetycznymi. Hipermetylacja MLH1 jest związana z brakiem syntezy białka kodowanego przez ten gen, z MSI oraz z występowaniem sporadycznego CRC. Przywrócenie ekspresji MLH1 poprzez demetylację jego sekwencji promotorowej wskazuje, że nieprawidłowa metylacja tego genu jest przyczyną a nie skutkiem transformacji nowotworowej w CRC [37,38]. Białko p16 jest inhibitorem cyklino-zależnych kinaz, które hamuje podziały komórkowe. Hipermetylacja p16 ma miejsce u 40% chorych na CRC [39]. Ponadto, hipermetylacja sekwencji promotorowej p16 występuje częściej w gruczolaku kosmkowym oraz cewkowo-kosmkowym [40]. Występowanie tych gruczolaków jest związane z wyższą podatnością na bardziej inwazyjnego gruczolakoraka. Białko p16 jest kodowane przez ten sam gen, co białko p14, CDKN2A. Białko p14 odpowiada za stabilizację p53, którego mutacje są często obserwowane w CRC [41]. MGMT koduje białko biorące udział w bezpośredniej naprawie uszkodzeń alkilacyjnych DNA [42,43]. Niedobór MGMT prowadzi do zwiększenia podatności na leczenie glejaka alkilującymi chemioterapeutykami, co podnosi skuteczność terapii z lekami alkilującymi [44-46]. Niedobór ten jest przeważnie spowodowany hipermetylacją MGMT [46-51]. Działanie czynników demetylujących przywraca ekspresję MGMT in vitro [47]. Utrata funkcji MGMT prowadzi do zwiększenia częstości tranzycji G>A [49,50]. Wysunięto zatem hipotezę, iż hipermetylacja MGMT zaburza naprawę DNA, co zwiększa udział tych mutacji promując nowotworzenie, a tranzycja G>A jest najczęściej obserwowaną mutacją genu KRAS [49]. Zauważono również dodatnią korelację pomiędzy hipermetylacją MGMT a mutacją G>A w p53 [51]. Proces nowotworzenia w CRC jest procesem wieloletnim obejmującym transformację tkanki prawidłowej do gruczolaka, a następnie do gruczolakoraka, który Rycina 4. Sekwencja zaburzeń epigenetycznych, które mogą mieć znaczenie dla raka jelita grubego. Wymienione zostały geny, których hipermetylacja zachodzi specyficznie na poszczególnych etapach w sekwencji gruczolak-gruczolakorak

5 dalej może ulegać progresji. Zmiany histologiczne guza korelują ze zmianami zachodzącymi na poziomie molekularnym, w tym zmianami wzoru metylacji DNA. CRC wykazuje charakterystyczny dla siebie wzór metylacji DNA. Zmiany wzoru metylacji DNA zachodzą na każdym etapie transformacji nowotworowej, a nawet w stanach przednowotworowych [30] (Ryc. 4). W sekwencji gruczolak-gruczolakorak prowadzącej do CRC najpierw następują zmiany metylacji sekwencji promotorowych genów: JAM2, CNRIP1, ADHFE1, IRF4, ST6GALNAC5, NRG1, FLI1, EYA4, TWIST1, SLC5A8, SFR2, SFR4, SFR5, ITGA4, CDH1, APC, DAPK1 oraz p14 prowadzące od prawidłowych komórek nabłonka jelita grubego do gruczolaka [52-56]. Hipermetylacja genów FLI1, ST6GAL- NAC5, TWIST1, ADHFE1, JAM2, IRF4, CNRIP1, NRG1 oraz EYA4 jest obserwowana w stadium gruczolaka jelita grubego i modyfikacja ta utrzymuje się również w stadium gruczolakoraka [52]. Należy przy tym zaznaczyć, że hipermetylacja TWIST oraz EYA4 towarzyszy starzeniu się organizmu. W prawidłowych komórkach błony śluzowej jelita grubego SLC5A8 jest niezmetylowany i podlega transkrypcji [53]. W gruczolakoraku oraz w gruczolaku zaobserwowano hipermetylację SLC5A8 u 59% pacjentów, zatem należy przyjąć, że hipermetylacja zachodzi najpóźniej w stadium gruczolaka. Również w liniach komórkowych CRC odnotowano hipermetylację SLC5A8 (52%). Z przeprowadzonych badań wynika, że hipermetylacja SLC5A8 jest specyficzna, gdyż nie obserwowano metylacji SLC5A8 w żadnym przypadku komórek prawidłowych pochodzących z błony śluzowej jelita grubego. Wyciszenie ekspresji SFR2, SFR4, SFR5 wynikające z hipermetylacji występowało w CRC, gruczolaku oraz w zmianach przednowotworowych zwanych aberracjami krypt [54]. Różnice w hipermetylacji tych genów pomiędzy różnymi stopniami zaawansowania nowotworu nie były statystycznie istotne, przy czym wyciszenie ekspresji genów było częstsze w gruczolakoraku niż w gruczolaku. Z kolei żadna prawidłowa tkanka błony śluzowej jelita grubego nie wykazywała hipermetylacji SFR2, SFR4, SFR5. Hipermetylacja ITGA4 występowała w prawidłowych komórkach błony śluzowej jelita grubego (6%), w gruczolaku (75%) oraz w gruczolakoraku (92%) [55]. Działanie 5-aza-2 -deoksycytydyną, czynnikiem powodującym demetylację DNA, na linie komórkowe CRC powodowało zwiększenie ekspresji ITGA4, co wskazuje na hamowanie ekspresji tego genu na drodze hipermetylacji DNA. Ponadto hipermetylacja występowała częściej w zaawansowanym (87%) niż we wczesnym (54%) gruczolaku. Inne badania pokazały, że częstość hipermetylacji APC oraz DAPK1 jest wyższa w gruczolaku niż w prawidłowej błonie śluzowej jelita grubego, a jeszcze wyższa jest w gruczolakoraku [56]. Hipermetylacja CDH1, p14 oraz MGMT występuje częściej w gruczolaku w porównaniu z tkanką prawidłową, natomiast nie ma istotnej różnicy pomiędzy częstością występowania hipermetylacji w gruczolaku i gruczolakoraku [56]. Zaburzenia metylacji DNA występują również na dalszych etapach transformacji nowotworu. Hipermetylacja MGMT, HLTF oraz p16 występuje w gruczolaku oraz utrzymuje się w gruczolakoraku, przy czym największy wzrost częstości hipermetylacji tych genów towarzyszy transformacji od wczesnego do późnego gruczolaka [56,57]. Ponadto w prawidłowej tkance jelita grubego nie obserwuje się metylacji tych genów. Natomiast przejściu od gruczolaka do gruczolakoraka towarzyszy hipermetylacja TIMP3, COX- 2, GSTP1, hmlh1, RASSF1A [56,57]. W badaniach porównujących COX-2, GSTP1, hmlh1, TIMP-3 oraz RASSF1A obserwowano hipermetylację w gruczolaku u 6% pacjentów i hipermetylację w gruczolakoraku u większości badanych [56]. Hipermetylacja TIMP3 nie występuje w prawidłowej tkance jelita grubego, natomiast stopniowo zwiększa się począwszy od gruczolaka do metastatycznego gruczolakoraka [35]. Również obserwuje się zmianę metylacji w genach BOLL, CABYR EFEMP1, FBLN2, FOXL2, GNB4, GSTM3, HoxD1, Jph3, MINT1, MINT2, MINT3, MINT12 i MINT31 w gruczolakoraku w porównaniu do prawidłowych komórek nabłonka, jednakże nie wiadomo, na którym etapie transformacji nowotworowej zachodzi ta zmiana [30]. METYLACJA DNA A WIEK Wraz z wiekiem zwiększa się ryzyko zachorowania na CRC oraz lokalna hipermetylacja DNA, natiomiast globalny poziom hipermetylacji DNA obniża się [58]. Około połowa genów, których hipermetylacja zwiększa się wraz z wiekiem jest związana z patogenezą CRC, co sugeruje udział hipermetylacji tych genów w zwiększonej podatności na CRC związanej ze starzeniem [59]. Ponieważ wraz z wiekiem obniża się poziom globalnej hipermetylacji DNA, która jest również obserwowana w CRC, metylacja/demetylacja DNA w procesach starzenia i nowotworzeniu może być wspólna [59-61]. Pokazano zależną od starzenia hipermetylację kilku genów, włączając APC, AXIN2, DKK1,ESR1, HPP1, IGF2, N33, p16, SFRP1, SFRP2 oraz SFRP4 w prawidłowych komórkach nabłonka jelita grubego [62,63]. Ponadto wraz z wiekiem obniża się ekspresja i aktywność DNMT1, co hamuje zachowawczą (poreplikacyjną) metylację DNA i tym samym odpowiada za globalną hipometylację DNA, a podwyższa się ekspresja DNMT3a i DNMT3b, a zatem i lokalna hipermetylacja DNA de novo [64,65]. W następstwie tego kontrola transkrypcji genów kodujących metylotransferazy DNA może prowadzić do globalnej hipometylacji oraz lokalnej hipermetylacji związanej ze starzeniem i zwiększać podatność na CRC wraz z wiekiem. EPIGENOTYPY CRC Wyróżnia się trzy szlaki zaburzeń prowadzące do CRC: MSI, niestabilność chromosomową (CIN) oraz fenotyp metylatora wysp CpG. Szlaki te nie zostały jednoznacznie zdefiniowane, więc nie wykluczają się wzajemnie. Metylacja wielu wysp CpG prowadzi do powstania CIMP, który charakteryzuje się współwystępowaniem zmian genetycznych razem z epigenetycznymi, które prowadzą do wyciszenia ekspresji genów na poziomie transkrypcji poprzez hipermetylację DNA ich regionów promotorowych. Około 20% CRC jest CIMP-dodatnich [66]. Charakteryzują się one hipermetylacją powyżej 60% genów, które zostały wybrane jako wyznaczniki CIMP. Grupa genów, które określają fenotyp CIMP wymaga standaryzacji, aby umożliwić korelowanie wyników badań, gdyż w różnych publikacjach grupy genów determinujące CIMP są odmienne [55,67-71]. Grupa Postępy Biochemii 59 (3)

6 Tabela 1. Symbole, nazwy i funkcje genów, których zaburzona metylacja może mieć znaczenie w transformacji nowotworowej komórek jelita grubego. Gen Symbol Nazwa (w jęz. ang) Funkcja genu ADHFE1 APC alcohol dehydrogenase, iron containing, 1 adenomatous polyposis coli białko kodowane przez ten gen bierze udział w metabolizmie alkoholi i lipidów oraz w glikolizie gen supresorowy, którego produkt jest antagonistą szlaku Wnt; mutacje w tym genie powodują rodzinną polipowatość gruczolakowatą - stan przedrakowy, który przeważnie prowadzi do powstania raka jelita grubego AXIN2 axin 2 białko kodowane przez ten gen reguluje stabilność β-kateniny w szlaku Wnt BOLL bol, boule-like (Drosophila) gen ten należy do rodziny genów DAZ (ang. deleted in azoospermia), jego produkt jest niezbędny do rozwoju komórek płciowych BRAF v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 protoonkogen kodujący kinazę serynowo-treoninową należącą do rodziny kinaz raf/ mil. BRAF reguluje szlak sygnałowy kinaz MAP/ERK, regulując podział i różnicowanie komórek; mutacje w tym genie są związane z występowaniem wielu nowotworów CABYR calcium binding tyrosine-(y)- phosphorylation regulated produkt białkowy tego genu odpowiada za ruchliwość plemników w spermie CACNA1G calcium channel, voltagedependent, T type, gen koduje białko budujące kanał wapniowy typu T alpha 1G subunit CD44 CD44 molecule gen koduje powierzchniowy receptor kwasu hialuronowego biorący udział w oddziaływaniu komórka-komórka, w adhezji i migracji komórek CD109 CD109 molecule gen ten koduje białko należące do nadrodziny alpha2-makroglobulin CDH1 cadherin 1 koduje kadherynę glikoproteinę regulującą adhezję typu komórkakomórka; mutacje tego genu są związane z występowaniem różnych nowotworów, a utrata funkcji z progresją nowotworu CDKN2A; p14; p16 CNRIP1 COX-2 CXCL8 (IL8) interleukin 8 CXCL12 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A cannabinoid receptor interacting protein 1 MT-CO2 mitochondrially encoded cytochrome c oxidase II chemokine (C-X-C motif) ligand 12 gen supresorowy, którego produkt białkowy bierze udział w regulacji puntu kontrolnego G1 cyklu komórkowego. Często obserwuje się jego mutację lub delecję w nowotworach koduje receptor sprzężony z białkami G, który bierze udział w plastyczności synaptycznej, neuroprotekcji, zmniejszeniu bólu czy pobudzaniu apetytu koduje oksydazę cytochromu c białko kodowane przez ten gen należy do rodziny chemokin CXC, jeden z głównych mediatorów reakcji zapalnej, ale również czynnik angiogenezy gen kodujący alfa chemokinę pochodzącą z komórek zrębowych, przedstawiciela rodziny interkryn; białko to jest ligandem dla receptora sprzężonego z białkiem G DAPK1 death-associated protein kinase produkt białkowy tego genu reguluje program śmierci komórkowej zależny od interferonu γ DKK1 EFEMP1 dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1 EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 koduje białko sekrecyjne należące do rodziny Dickkopf, które reguluje rozwój embrionalny poprzez zahamowanie szlaku Wnt koduje glikoproteinę macierzy zewnątrzkomórkowej należącą do rodziny fibulin. Zwiększoną ekspresję tego genu obserwuje się w glejakach złośliwych, gdzie może wpływać na złośliwy fenotyp ESR1 estrogen receptor 1 koduje receptor estrogenu będący czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym przez ligand EVL Enah/Vasp-like koduje białko związane z aktyną biorące udział w przebudowie cytoszkieletu i polaryzacji komórek EYA4 eyes absent homolog 4 (Drosophila) koduje czynnik transkrypcyjny należący do rodziny genów eyes absent (EYA) FBLN2 fibulin 2 koduje białko macierzy zewnątrzkomórkowej, należące do rodziny fibulin, wiążące wapń i inne ligandy FLI1 Friend leukemia virus integration 1 gen kodujący czynnik transkrypcyjny, jego translokacje są notowane w mięsaku Ewinga oraz w ostrej białaczce limfoblastycznej FLNC filamin C, gamma koduje filaminę białko sieciujące filamenty aktynowe FOXL2 forkhead box L2 koduje czynnik transkrypcyjny z rodziny Forkhead, który może odgrywać rolę w rozwoju i funkcjonowaniu jajników GATA4 GATA binding protein 4 białko kodowane przez ten gen należy do czynników transkrypcyjnych GATA GSTP1 glutathione S-transferase pi 1 S-transferaza glutationowa kodowana przez ten gen bierze udział w detoksyfikacji wykorzystując zredukowany glutation GNB4 guanine nucleotide binding protein (G protein), koduje podjednostkę β białka G beta polypeptide 4 GSTM3 glutathione S-transferase mu 3 koduję S-transferazę glutationową należącą do klasy mu, uczestnicząca w detoksykacji HLTF helicase-like transcription factor koduje białko należące do rodziny SWI/SNF, której przedstawiciele mają aktywność helikaz i ATPaz oraz regulują transkrypcję genów poprzez zmianę struktury chromatyny HoxD1 homeobox D1 gen homeotyczny koduje przedstawiciela rodziny Antp homeobox, wiążącego się do DNA i pełniącego funkcję czynnika transkrypcyjnego biorącego udział w rozwoju i różnicowaniu kończyn 272

7 HPP1 ID4 IGF2 IGFBP3 hyperpigmentation, progressive, 1 inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helixloop-helix protein insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) insulin-like growth factor binding protein 3 IRF4 interferon regulatory factor 4 IRF8 interferon regulatory factor 8 ITGA4 integrin, alpha 4 (antigen CD49D, alpha 4 subunit of VLA-4 receptor) JAM2 junctional adhesion molecule 2 Jph3 junctophilin 3 KRAS MGMT MINT1 MINT2 MINT3 v-ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog O-6-methylguanine-DNA methyltransferase amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 1 amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 2 amyloid beta (A4) precursor protein-binding, family A, member 3 prawdopodobnie gen ten koduje białko transmembranowe mające domeny folistatyny oraz domeny podobne do naskórkowego czynnika wzrostu gen supresorowy koduje inhibitor hamujący transkrypcję rodziny białek wiążących się do DNA (ID) koduje insulinopodobny czynnik wzrostu polipeptyd wykazujący duże podobieństwo do insuliny, który bierze udział we wzroście i rozwoju. Matczyna kopia tego allelu jest wyciszona; zmiany modyfikacji epigenetycznych tego genu są związane z guzem Wilmsa gen ten koduje białko wiążące się do insulinopodobnego czynnika wzrostu koduje przedstawiciela rodziny czynników transkrypcyjnych IRF (czynników regulatorowych interferonu), które regulują interferon i ekspresję genów indukowanych przez interferon w odpowiedzi na zakażenie wirusowe; białko jest specyficzne dla limfocytów, gdzie reguluje odpowiedź immunologiczną wrodzoną i nabytą poprzez regulację szlaku receptora Toll-podobne (TLR) koduje czynnik transkrypcyjny należący do rodziny czynników regulatorowych interferonu (IRF) wiążący się do białka wiążącego sekwencję komplementarną dla interferonu (ICSBP) koduje białko należące do rodziny integryn koduje białko należące do nadrodziny immunoglobulin oraz rodziny białek połączeń komórkowych JAM. Białko błonowe typu I, występujące w połączeniach komórek epitelialnych i endotelialnych, które działa jako cząsteczka adhezyjna dla komórek układu immunologicznego koduje białko będące składnikiem połączeń międzykomórkowych pomiędzy błoną komórkową a siateczką endoplazmatyczną/sarkoplazmatyczną koduje białko należace do nadrodziny małych GTPaz; zmutowane białko związane z występowaniem wielu typów nowotworów koduje białko naprawy DNA specyficzne dla O 6 -metyloguaniny koduje przedstawiciela rodziny białek X11. Neuronalne białko adaptorowe stabilizujące prekursorowe białko amyloidu (APP) i inhibujące proteolizę fragmentów APP, które odkładają się w mózgach pacjentów w chorobą Alzheimera podobne funkcje jak MINT1 koduje białko adaprotowe z rodziny X11, które oddziałuje z prekursorowym białkiem amyloidu (APP) choroby Alzheimera MINT12 koduje białko adaptorowe z rodziny X11 MINT31 podobne funkcje jak MINT12 MLH1 mutl homolog 1, colon cancer, gen kodujący białko systemu naprawy błędnie sparowanych nukleotydów MMR, którego nonpolyposis type 2 (E. coli) zmutowana wersja często występuje w dziedzicznym niepolipowatym raku jelita grubego N33 tumor suppressor candidate 3 transporter magnezu jest kodowany przez N33; białko to może brać udział w N-glikozylacji NDRG4 NDRG family member 4 członek rodziny genów wyciszanych przez N-myc koduje białko należące do alfa/beta nadrodziny hydrolazy NEUROG1 neurogenin 1 koduje regulator transkrypcji NRG1 neuregulin 1 koduje białko sygnałowe regulujące oddziaływanie komórka-komórka p53 tumor protein p53 gen supresorowy o aktywności czynnika transkrypcyjnego; mutacje tego genu są związane z występowaniem wielu różnych nowotworów RASSF1A Ras association (RalGDS/AF- 6) domain family member 1 RUNX3 runt-related transcription factor 3 SEPT9 septin 9 gen koduje białko podobne do białek efektorowych RAS. Utrata lub zaburzona ekspresja tego genu jest związana z patogenezą wielu nowotworów koduje przedstawiciela rodziny czynników transkrypcyjnych zawierających domenę runt. Gen supresorowy, który często ulega delecji lub jego ekspresja jest wyciszona w nowotworach gen kodujący białko należące do rodziny septyn biorących udział w cytokinezie i kontroli cyklu komórkowego; translokacja chromosomowa pomiędzy fragmentem DNA zawierającym ten gen i genu MLL powoduje powstanie ostrej białaczki mielomonocytowej SFRP1 secreted frizzled-related protein 1 gen koduje przedstawiciela rodziny białek SFRP modulujących szlak Wnt SFR2 podobne funkcje jak SFRP1 SFR4 podobne funkcje jak SFRP1 SFR5 podobne funkcje jak SFRP1 SLC5A8 SOCS1 solute carrier family 5 (iodide transporter), member 8 koduje białko transportujące zależne do sodu. Bierze udział w dyfuzji wspomaganej jonów jodkowych suppressor of cytokine signaling 1 koduje inhibitor STAT należący do rodziny supresorów sygnalizacji cytokin (SSI lub SOCS). Postępy Biochemii 59 (3)

8 ST6GALNAC5 TIMP3 TWIST1 ST6 (alpha-n-acetyl-neuraminyl- 2,3-beta-galactosyl-1,3)- N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 5 TIMP metallopeptidase inhibitor 3 twist basic helix-loop-helix transcription factor 1 białko kodowane przez ten gen należy do rodziny sjalotransferaz, które modyfikują białka i ceramidy na powierzchni komórek, przez co mogą zaburzać oddziaływanie komórka-komórka oraz komórka-macierz zewnątrzkomórkowa gen kodujący przedstawiciela rodziny białek TIMP, inhibitorów metaloproteinaz macierzowych biorących udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej gen kodujący czynnik transkrypcyjny, który może brać udział w determinacji i różnicowaniu komórek wyznaczników CIMP zaproponowana przez Parka i wsp., zwana też klasyczną, pozwalająca ocenić status CIMP obejmuje MLH1, p16, MINT1, MINT2 oraz MINT31 [70]. Druga z powszechnie używanych wyznaczników została zaproponowana przez Weisenberga i wsp. i zawiera geny NEU- ROG1, SOCS1, RUNX3, IGF2 oraz CACNA1G [67]. Oprócz wymienionych powyżej sugerowano jeszcze kilka grup wyznaczników dla CIMP [66,67,72,73]. Niezależnie od wybranych wyznaczników CIMP, fenotyp ten koreluje z hipermetylacją genów, w tym często z hipermetylacją sekwencji promotorowej MLH1, MSI, mutacją BRAF, c.1799t>a (p.v600e), brakiem mutacji w p53 oraz z występowaniem guza w proksymalnej części jelita grubego [71]. Zwykle wyróżnia się fenotypy CIMP+ oraz CIMP, gdzie CIMP przeważnie charakteryzuje się mutacją w p53 [74]. Część wyników badań sugeruje iż CIMP+ można podzielić na dwa podtypy: CIMP-high i CIMP-low. CIMP-high (CIMP1) charakteryzuje się silną hipermetylacją wielu genów, MSI oraz mutacją w BRAF, natomiast CIMP-low (CIMP2) hipermetylacją mniejszej liczby genów, podwyższoną metylacją genów, która jest zależna od starzenia, oraz mutacją w KRAS [74]. Mutacje w KRAS oraz BRAF przeważnie nie współwystępują ze sobą, gdyż białka te należą do tego samego szlaku przekazywania sygnału przez Ras. Obecnie trwa dyskusja, czy można wyróżnić dwa alternatywne szlaki prowadzące do CIMP, jeden oparty na mutacji w BRAF i drugi w KRAS. Badania prowadzone na liniach komórkowych wydają się potwierdzać istnienie dwóch alternatywnych szlaków. Linię komórkową pochodzącą z nabłonka jelita grubego, NCM460, transfekowano zmutowanym BRAF i obserwowano zwiększoną metylację MLH1 [75]. W drugim badaniu zastosowano linię komórkową embrionalnych fibroblastów myszy, NIH 3T3, którą transfekowano Ras, co powodowało hipermetylację specyficznych wysp CpG [76]. METASTAZA Podobnie jak poprzednie etapy kancerogenezy, metastazę poprzedzają molekularne zmiany w DNA w tym także zmiany wzoru metylacji DNA. Wyciszenie ekspresji genów supresorowych oraz genów kodujących inhibitory metastazy poprzez hipermetylację DNA ma zasadnicze znaczenie dla progresji CRC oraz nabywania bardziej złośliwego fenotypu. Część genów ulega hipermetylacji w zaawansowanym stadium transformacji nowotworowej. Hipermetylacja p16 występowała u pacjentów w stopniu zawansowania C i D wg klasyfikacji Dukesa w 75,9%, natomiast w stopniu A i B w 12,1% [77]. Ponadto hipermetylacja p16 była związana ze słabo zróżnicowanymi nowotworami oraz z krótszym czasem przeżycia pacjentów. Częstość hipermetylacji ID4 wynosiła w prawidłowej tkance 0% (0 na 9), w gruczolaku 0% (0 na 13), w pierwotnym gruczolakoraku 53% oraz w ogniskach przerzutowych w wątrobie 73% [78]. Dodatkowo, hipermetylacja ID4 była związana ze stopniem histopatologicznym guza oraz z krótszym czasem przeżycia pacjentów. DKK-1 jest białkiem hamującym szlak Wnt [79]. Hipermetylacja DKK-1 miała miejsce wyłącznie w gruczolakoraku (w stopniu zawansowania C i D wg klasyfikacji Dukesa) (17%) i była związana z represją transkrypcji tego genu. Działanie 5-aza-2 -deoksycytydyny przywraca ekspresję DKK-1. Z kolei niektóre geny, jak APC czy ESR1 są hipermetylowane na wczesnych etapach kancerogenezy i wydaje się, że odgrywają rolę w metastazie CRC [80,81]. Hipermetylowany APC częściej występuje w ogniskach przerzutowych CRC w wątrobie niż w guzie pierwotnym, a hipermetylacja ESR1 jest wykrywana w komórkach metastatycznych CRC w węzłach chłonnych [80,81]. Brak spadku ilości białka APC w ogniskach przerzutowych w wątrobie sugeruje, że hipermetylacja tego genu nie wpływa na wyciszenie jego ekspresji [80]. Natomiast hipermetylacja CXCL12, kodującego chemokinę, zachodzi w gruczolakoraku jelita grubego i jest związana z wyciszeniem transkrypcyjnym tego genu [82]. Zablokowanie metylotransferaz DNA poprzez dodanie 5-aza-2 - -deoksycytydyny lub poprzez knockout genów DNMT1 i DNMT3 zapobiegało metylacji promotora CXCL12 i włączało ponownie ekspresję tego genu. Reekspresja CXCL12 w komórkach CRC zmniejszała tworzenie ognisk przerzutowych u myszy oraz tworzenie ognisk w agarze. Hipermetylacja DNA w metastatycznych komórkach nowotworowych dotyczy również sekwencji promotorowych genów supresorowych, których produkty mogą brać udział w apoptozie. Zablokowanie apoptozy jest związane z fenotypem metastatycznym i jest wyznacznikiem progresji nowotworu. Hipermetylacja genu czynnika regulatorowego 8 interferonu (IRF8) wycisza jego ekspresję [83]. IRF8 jest regulatorem szlaku apoptozy zależnym od Fas oraz supresorem metastazy [84]. W CRC hipermetylację IRF8 obserwuje się w guzach przerzutowych w wątrobie w 83% (10 na 12) natomiast w guzach pierwotnych w 43% (9 na 21) [83]. Wyciszenie transkrypcyjne tego genu poprzez hipermetylację DNA było związane z opornością komórek CRC na apoptozę oraz z nabywaniem fenotypu metastatycznego [84]. Niektóre geny, które ulegają hipermetylacji we wczesnym stadium kancerogenezy i pozostają zmodyfikowane w czasie progresji nowotworu, mogą ponownie ulegać reekspresji w komórkach nowotworowych znajdujących się w węzłach chłonnych czy w ogniskach przerzutowych [85]. Przykładem takiego genu może być CDH1 kodujący E-kadherynę. E-kadheryna jest białkiem adhezyjnym, tworzy kompleksy z kateniną zapewniając integralność tkanki nabłonkowej. Hipermety

9 lacja tego genu zachodziła jeszcze przed stadium gruczolaka prowadząc dalej do utraty adhezji komórkowej i do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) [86]. Z kolei w ogniskach przerzutowych CDH1 był zdemetylowany i podlegał ponownej ekspresji, dzięki czemu komórka nowotworowa mogła ulec przejściu mezenchymalno- -nabłonkowemu (MET) i adhezji do elementów macierzy komórkowej i zewnątrzkomórkowej w miejscu odległym od guza pierwotnego. Podobny mechanizm obserwuje się dla CD44 [85]. Oprócz hipermetylacji DNA również hipometylacja genów towarzyszy metastazie w CRC. Przykładem może być hipometylacja sekwencji LINE-1. Poziom metylacji LINE-1 obniżał się wraz z progresją CRC [87]. Obniżony poziom hipermetylacji tej sekwencji występował w gruczolaku oraz gruczolakoraku w porównaniu z prawidłową tkanką lub z nowotworową tkanką mezenchymalną, przy czym obserwowano brak znaczącej różnicy w poziomie hipometylacji LINE-1 pomiędzy gruczolakiem a wczesnym gruczolakorakiem. Natomiast największy wzrost hipometylacji tej sekwencji odnotowano dla IV stopnia zaawansowania CRC w porównaniu z innymi stopniami. Również hipometylacja LINE-1 była wyższa u pacjentów, u których komórki nowotworowe były obecne w węzłach chłonnych niż u pacjentów bez zajętych węzłów chłonnych. Hipometylacja LINE-1 była związana ze zmniejszonym czasem przeżycia bez objawów choroby oraz z wznową CRC, gdy guz występował w bliższym odcinku jelita grubego [88,89]. Ostatnio przeprowadzone badania dotyczące ekspresji CXCL8 oraz hipometylacji tego genu pokazały, że hipometylacja CXCL8 występowała w CRC (64%), natomiast brak jej w tkance prawidłowej [90]. Hipometylacja tego genu korelowała ze zwiększonym poziomem białka CXCL8. Ponadto, wyniki tych badań wskazują, że u pacjentów z przerzutami hipermetylacja CXCL8 wykazywała mniejszą częstotliwość niż w nowotworze jelita grubego bez przerzutów. KWAS FOLIOWY Metabolizm kwasu foliowego (metabolizm fragmentów jednowęglowych) ma zasadnicze znaczenie w syntezie puryn i pirymidyn oraz w konwersji homocysteiny do metioniny, która jest prekursorem SAM, substratu dla metylacji DNA [91]. Kwas foliowy jest dostarczany do organizmu wyłącznie wraz z pożywieniem [92]. Jego niedobór może odgrywać rolę w występowaniu nowotworów, m.in.: raka piersi, jajnika, trzustki, mózgu, płuc czy szyjki macicy, jednakże najsilniejszy jego efekt jest związany z występowaniem CRC [92]. Kwas foliowy utrzymuje stabilność genomu poprzez regulację biosyntezy, naprawy i metylacji DNA. Jeżeli zasoby kwasu foliowego są ograniczone, metylacja cytozyny jest utrudniona, co prowadzi do globalnej hipometylacji DNA lub zmian w metylacji genów tkankowo-specyficznych, co może stymulować nieprawidłową aktywację protoonkogenów. Jednakże niedobór kwasu foliowego może być również związany z lokalną hipermetylacją DNA, szczególnie w genach supresorowych [92]. Zjawisko to jest związane z sekwestracją DNMT z widełek replikacyjnych DNA do rejonów uszkodzeń DNA indukowanych niedoborem kwasu foliowego, co powoduje globalną hipometylację i lokalną hipermetylację DNA [92]. Suplementacja kwasem foliowym może pełnić funkcję ochronną przeciwko występowaniu CRC w większości przypadków, za wyjątkiem tych osób, u których wystąpiły gruczolaki, albowiem u nich kwas foliowy może stymulować transformację nowotworową [93]. Prawdopodobną przyczyną tego efektu jest dostarczenie prekursorów do syntezy DNA, aktywacja protoonkogenów oraz wyciszenie ekspresji genów supresorowych z udziałem kwasu foliowego [91]. Znaczenie metabolizmu kwasu foliowego dla metylacji DNA potwierdzają skutki występowania polimorfizmu c.677c>t genu MTHFR biorącego udział w metabolizmie kwasu foliowego, powodującego zamianę waliny na alaninę, który prowadzi do obniżenia aktywności enzymatycznej tego białka u heterozygot (35%) i homozygot (70%) [92]. Poziom metylacji DNA był wysoki w kolonocytach o genotypie TT, hodowanych w warunkach optymalnego lub wysokiego stężenia kwasu foliowego. Obniżenie dostępności kwasu foliowego powodowało hipometylację DNA w tych komórkach w porównaniu z homozygotą CC. Polimorfizm c.677c>t genu MTHFR u pacjentów z CRC, u których stężenie kwasu foliowego/witaminy B 12 było wysokie, był związany z metylacją genów specyficznych dla nowotworów (P16, hmlh1 oraz hmsh2) [94]. Funkcjonalne polimorfizmy zidentyfikowano w prawie wszystkich genach uczestniczących w metabolizmie fragmentów jednowęglowych. Mogą one mieć wpływ na biodostępność metabolitów tego szlaku i przez to modulować ryzyko wystąpienia CRC. W 1998 wprowadzono w USA i Kanadzie obowiązek wzbogacania mąki i ziaren zbóż kwasem foliowym w celu zmniejszenia częstości występowania wad cewy nerwowej u noworodków. Analiza statystyk występowania nowotworów w tych krajach sugeruje, że zwiększenie spożycia kwasu foliowego jest związane ze wzrostem częstości występowania CRC, wskazując na ważną rolę tego składnika w transformacji nowotworowej [92]. ZASTOSOWANIE KLINICZNE Pomimo doskonalenia technik chirurgicznych oraz terapii adjuwantowej notuje się jedynie nieznaczną poprawę przeżycia pacjentów w zaawansowanym stadium CRC [95]. Dlatego też poszukuje się i rozwija metody mogące służyć wykrywaniu zmian przednowotworowych. CRC cechuje się dużą częstością występowania, powolnym tempem progresji zmian pierwotnych oraz wyższą przeżywalnością pacjentów, u których wcześnie wykryto chorobę. Te cechy CRC są odpowiednie do stworzenia programu badań przesiewowych w kierunku CRC. Nowe techniki, w tym analiza metylacji DNA, otwiera perspektywę na utworzenie puli molekularnych wyznaczników DNA do celów przesiewowych w diagnostyce CRC. Metylacja DNA jest wysoce specyficzna dla danej choroby, również CRC, dlatego też opracowuje się metody analizy metylacji DNA mające zastosowanie kliniczne w diagnozowaniu i leczeniu CRC. Testy te są tańsze i bardziej dokładne od wykorzystywanych obecnie technik. Ponieważ zmiany wzoru metylacji DNA zachodzą jeszcze w stanach przednowotworowych, metody oparte na ich analizie wydają się doskonałe do celów przesiewowych. Ponadto, poszukiwanie nowych metod opartych na analizie metylacji DNA wpisuje się w nurt koncepcji tworzenia Postępy Biochemii 59 (3)

10 jak najmniej inwazyjnych metod diagnostycznych oraz przesiewowych, zastępujących powszechnie stosowaną kolonoskopię. Kolonoskopia jest metodą drogą oraz inwazyjną, mogącą skutkować powikłaniami pozabiegowymi. Drugim po kolonoskopii, najczęściej stosowanym testem jest test na krew utajoną w kale. Jest on tani i łatwy do przeprowadzenia, ale mało czuły i swoisty dla gruczolaków jelita grubego. Natomiast, analiza metylacji DNA to bardzo czuła metoda, gdzie materiał do badań może stanowić krew, osocze lub kał pacjenta. Obecnie na rynku są dostępne dwa komercyjne testy do diagnozy CRC wykorzystujące zmiany we wzorze metylacji DNA. Pierwszy z nich, pod nazwą ColoGuard, jest w fazie badań klinicznych [96]. W teście tym analizowana jest metylacja genu wimentyny (VIM), który jest nieprawidłowo zmetylowany w większości CRC (53-84%). Materiałem do badań jest kał, test oparty jest na technice PCR (ang. polymerase chain reaction) i cechuje się dużą czułością, jednakową dla pacjentów w I-III stadium CRC (83%), i swoistością (82%) [97]. Z drugiej strony, w Europie i na Środkowym Wschodzie rozpropagowany jest test o nazwie Epipro- Colon opierający się na analizie metylacji SEPT9, gdzie materiał stanowi krew. Obecnie prowadzone są badania nad poszukiwaniem takich zmian profilu metylacji DNA powiązanych z nowotworzeniem CRC, które mogłyby posłużyć jako specyficzne i swoiste wyznaczniki CRC. Wśród genów-kandydatów znajdują się NDRG4, GATA4 czy OSM, których specyficzność względem CRC wynosiła odpowiednio 100%, 84% i 95% w próbkach kału pacjentów [98]. Należy podkreślić, że metylacja NDRG4 występowała niezależnie od wieku u pacjentów z CRC. Pomimo względnie niskiej wrażliwości, metylacja HLTF w surowicy pacjentów była związana z wielkością guza, stopniem i agresywnością nowotworu. Metylacja HLTF jest związana ze zwiększonym ryzykiem wznowy u pacjentów z CRC i nie zależy od ryzyka zgonu. Wyniki te wskazują, że metylacja HLTF w surowicy pacjentów z CRC ma potencjał, aby stać się wyznacznikem prognostycznym. Jak wskazują ostatnie badania, wyciszenie ekspresji genów macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak IGFBP3, EVL, CD109 czy FLNC, jest związane z gorszą prognozą przeżycia pacjentów z CRC, co stanowi dogodne pole do poszukiwania nowych wyznaczników prognostycznych CRC [94]. PODSUMOWANIE Zmiany epigenetyczne występują obok mutacji genetycznych podczas transformacji prawidłowych komórek błony śluzowej jelita grubego do komórek CRC. Przy czym zaburzenia wzoru metylacji DNA zachodzą częściej niż mutacje. W większości przypadków CRC następuje globalna hipometylacja i lokalna hipermetylacja DNA. Zmiany wzoru metylacji DNA mogą zachodzić na wczesnych etapach kancerogenezy CRC, a nawet w stanach przednowotworowych. Ponadto nieprawidłowa metylacja wybranych genów jest związana z procesem starzenia i ma wpływ na indukcję i progresję CRC. Niektóre zmiany wzoru metylacji DNA mogą występować na dalszych etapach w sekwencji gruczolak-gruczolakorak i prowadzić do progresji nowotworu. Te zmiany metylacji DNA przyczyniają się do molekularnej niejednorodności CRC, co przedstawiają molekularne podtypy CRC. Kilka miejsc metylacji DNA jest stosowanych lub testowanych jako molekularne wyznaczniki w diagnostyce CRC. Dalsze badania prowadzące do wyjaśnienia molekularnego mechanizmu nieprawidłowej metylacji DNA w CRC pozwolą na lepsze zrozumienie roli zmian epigenetycznych w patogenezie CRC i wykorzystanie zdobytej wiedzy do celów klinicznych. PIŚMIENNICTWO 1. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D (2011) Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 61: Bestor TH (2000) The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 9: Ehrlich M, Gama-Sosa MA, Huang LH, Midgett RM, Kuo KC, Mc- Cune RA, Gehrke C (1982) Amount and distribution of 5-methylcytosinein human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res 10: Shen JC, Rideout WM, Jones PA (1994) The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res 22: Korolev VG (2005) Base excision repair of DNA: glycosylases. Russ J Genet 41: Bird A (2002) DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 16: Takai D, Jones PA (2002) Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. Proc Natl Acad Sci USA 99: Felle M, Hoffmeister H, Rothammer J, Fuchs A, Exler H, Längst G (2011) Nucleosomes protect DNA from DNA methylation in vivo and in vitro. Nucl Acids 39: Dickson J, Gowher H, Strogantsev R, Gaszner M, Hair A, Felsenfeld G, West AG (2010) VEZF1 elements mediate protection from DNA methylation. PLoS Genet 6: e Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D (1985) A fraction of the mouse genome that is derived from islands of non-methylated, CpG-rich DNA. Cell 40: Gardiner-Garden M, Frommer M (1987) CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol 196: Wang Y, Leung FCC (2004) An evaluation of new criteria for CpG islands in the human genome as gene markers. Bioinformatics 20: Comb M, Goodman HM (1990) CpG methylation inhibits proenkephalin gene expression and binding of the transcription factor AP-2. Nucleic Acids Res 18: Prokhortchouk E, Hendrich B (2002) Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs? Oncogene 21: Daniel JM, Spring CM, Crawford HC, Reynolds AB, Baig A (2002) The p120 ctn -binding partner Kaiso is a bi-modal DNA-binding protein that recognizes both a sequence-specific consensus and methylated CpG dinucleotides. Nucleic Acids Res 30: Głowacki S, Błasiak J (2013) Rola 5-hydroksymetylocytozyny i białek Tet w epigenetycznej regulacji ekspresji genów. Postepy Biochem 59: Kim GD, Jingwei N, Kelesoglu N, Roberts RJ, Pradhan S (2002) Cooperation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. EMBO J 21: Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E (1999) DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99: Hermann A, Gowher H, Jeltsch A (2004) Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cell Mol Life Sci 61: Leonhardt H, Page AW, Weier HU, Bestor TH (1992) A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell 71:

11 21. Feinberg A, Vogelstein B (1983) Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301: Feinberg AP (2004) The epigenetics of cancer etiology. Semin Cancer Biol 14: Ehrlich M (2002) DNA methylation in cancer: too much, but also too little. Oncogene 21: Tra J, Kondo T, Lu Q, Kuick R, Hanash S, Richardson B (2002) Infrequent occurrence of age-dependent changes in CpG island methylation as detected by restriction landmark genome scanning. Mech Ageing Dev 123: Costello JF, Frühwald MC, Smiraglia DJ, Rush LJ, Robertson GP, Gao X, Wright FA, Feramisco JD, Peltomäki P, Lang JC, Schuller DE, Yu L, Bloomfield CD, Caligiuri MA, Yates A, Nishikawa R, Su Huang HJ, Petrelli NJ, Zhang X, O Dorisio MS, Held WA, Cavenee WK, Plass C (2000) Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nat Genet 24: Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman G, Baylin SB, Issa JP (1999) CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci USA 96: Gonzalez-Zulueta M, Bender CM, Yang AS, Nguyen TD, Beart RW, Van Tornout JM, Jones PA (1995) Methylation of the 5 CpG island of the p16/cdkn2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res 55: Graff J, Herman JG, Lapidus RG, Chopra H, Xu R, Jarrard DF, Isaacs WB, Pitha PM, Davidson NK, Baylin SB (1995) E-cadherin expression is silenced by DNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas. Cancer Res 55: Cunningham J, Christensen ER, Tester DJ, Kim CY, Roche PC, Burgart LJ, Thibodeau SN (1998) Hypermethylation of the hmlh1 promoter in colon cancer with microsatellite instability. Cancer Res 58: Schuebel KE, Chen W, Cope L, Glöckner SC, Suzuki H, Yi JM, Chan TA, Neste LV, Criekinge W, van den Bosch S, van Engeland M, Ting AH, Jair K, Yu W, Toyota M, Imai K, Ahuja N, Herman JG, Baylin SB (2007) Comparing the DNA hypermethylome with gene mutations in human colorectal cancer. PLoS Genet 3: Widschwendter M, Fiegl H, Egle D, Mueller-Holzner E, Spizzo G, Marth C, Weisenberger DJ, Campan M, Young J, Jacobs I, Laird PW (2007) Epigenetic stem cell signature in cancer. Nat Genet 39: Jones PA, Laird PW (1999) Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet 21: Pasz-Walczak G, Jesionek-Kupnicka D (2004) Podstawowe mechanizmy kancerogenezy w jelicie grubym. Współcz Onkol 8: Neibergs H, Hein D, Spratt J (2002) Genetic profiling of colon cancer. J Surg Oncol 80: Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG (2001) A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res 61: Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup JM, Kolodner R (1997) Methylation of the hmlh1 promoter correlates with lack of expression of hmlh1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res 57: Herman JG, Umar A, Polyak K, Graff JR, Ahuja N, Issa JP, Markowitz S, Willson JKV, Hamilton SR, Kinzler KW, Kane MF, Kolodner RD, Vogelstein B, Kunkel TA, Baylin SB (1998) Incidence and functional consequences of hmlh1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 95: Veigl ML, Kasturi L, Olechnowicz J, Ma AH, Lutterbaugh JD, Periyasamy S, Li GM, Drummond J, Modrich PL, Sedwick WD, Markowitz SD (1998) Biallelic inactivation of hmlh1 by epigenetic gene silencing, a novel mechanism causing human MSI cancers. Proc Natl Acad Sci USA 95: Toyota M, Ho C, Ahuja N, Jair KW, Li Q, Ohe-Toyota M, Baylin SB, Issa IP (1999) Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res 59: Rashid A, Shen L, Morris JS, Issa JP, Hamilton SR (2001) CpG island methylation in colorectal adenomas. Am J Pathol 159: Honda R, Yasuda H (1999) Association of p19arf with Mdm2 inhibits ubiquitin ligase activity of Mdm2 for tumor suppressor p53. EMBO J 18: Ludlum DB (1990) DNA alkylation by the haloethylnitrosoureas: nature of modifications produced and their enzymatic repair or removal. Mutat Res 233: Pegg AE, Dolan ME, Moschel RC (1995) Structure, function, and inhibition of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51: Belanich M, Pastor M, Randall T, Guerra D, Kibitel J, Alas L, Li B, Citron M, Wasserman P, White A, Eyre H, Jaeckle K, Schulman S, Rector D, Prados M, Coons S, Shapiro W, Yarosh D (1996) Retrospective study of the correlation between the DNA repair protein alkyltransferase and survival of brain tumor patients treated with carmustine. Cancer Res 56: Jaeckle KA, Eyre HJ, Townsend JJ, Schulman S, Knudson HM, Belanich M, Yarosh DB, Bearman SI, Giroux DJ, Schold SC (1998) Correlation of tumor O6 methylguanine-dna methyltransferase levels with survival of malignant astrocytoma patients treated with bis-chloroethylnitrosourea: a Southwest Oncology Group study. J Clin Oncol 16: Silber JR, Blank A, Bobola MS, Ghatan S, Kolstoe DD, Berger MS (1999) O6-methylguanine-DNA methyltransferase-deficient phenotype in human gliomas: frequency and time to tumor progression after alkylating agentbased chemotherapy. Clin Cancer Res 5: Qian XC, Brent TP (1997) Methylation hot spots in the 5 flanking region denote silencing of the O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene. Cancer Res 57: Watts GS, Pieper RO, Costello JF, Peng YM, Dalton WS, Futscher BW (1997) Methylation of discrete regions of the O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) CpG island is associated with heterochromatinization of the MGMT transcription start site and silencing of the gene. Mol Cell Biol 17: Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG (1999) Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Res 59: Danam RP, Qian XC, Howell SR, Brent TP (1999) Methylation of selected CpGs in the human O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter region as a marker of gene silencing. Mol Carcinog 24: Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG (2001) Promoter hypermethylation of the DNA repair gene O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumorigenesis. Cancer Res 61: Oster B, Thorsen K, Lamy P, Wojdacz TK, Hansen LL, Birkenkamp- Demtröder K, Sørensen KD, Laurberg S, Orntoft TF, Andersen CL (2011) Identification and validation of highly frequent CpG island hypermethylation in colorectal adenomas and carcinomas. Int J Cancer 129: Li H, Myeroff L., Smiraglia D, Romero MF, Pretlow TP, Kasturi L, Lutterbaugh J, Rerko RM, Casey G, Issa JP, Willis J, Willson JKV, Plass C, Markowitz SD (2003) SLC5A8, a sodium transporter, is a tumor suppressor gene silenced by methylation in human colon aberrant crypt foci and cancers. Proc Natl Acad Sci USA 100: Qi J, Zhu YQ, Luo J, Tao WH (2006) Hypermethylation and expression regulation of secreted frizzled-related protein genes in colorectal tumor. World J Gastroenterol 12: Ausch C, Kim YH, Tsuchiya KD, Dzieciatkowski S, Washington MK, Paraskeva C, Radich J, Grady WM (2009) Comparative analysis of PCR-based biomarker assay methods for colorectal polyp detection from fecal DNA. Clin Chem 55: Lee S, Hwang KS, Lee HJ, Kim JS, Kang GH (2004) Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in colorectal neoplasia. Lab Invest 84: Postępy Biochemii 59 (3)

12 57. Kim YH, Petko Z, Dzieciatkowski S, Lin L, Ghiassi M, Stain S, Chapman WC, Washington MK, Willis J, Markowitz SD, Grady WM (2006) CpG island methylation of genes accumulates during the adenoma progression step of the multistep pathogenesis of colorectal cancer. Gen Chrom Cancer 45: Ahuja N, Issa JP (2000) Aging, methylation and cancer. Histol Histopathol 15: Wilson VL, Jones PA (1983) DNA methylation decreases in aging but not in immortal cells. Science 220: Fuke C, Shimabukuro M, Petronis A, Sugimoto J, Oda T, Miura K, Miyazaki T, Ogura C, Okazaki Y, Jinno Y (2004) Age related changes in 5-methylcytosine content in human peripheral leukocytes and placentas: an HPLC-based study. Ann Hum Genet 68: Fraga MF, Esteller M (2007) Epigenetics and aging: the targets and the marks. Trends Genet 23: Belshaw NJ, Elliott GO, Foxall RJ, Dainty JR, Pal N, Coupe A, Garg D, Bradburn DM, Mathers JC, Johnson IT (2008) Profiling CpG island field methylation in both morphologically normal and neoplastic human colonic mucosa. Br J Cancer 99: Lao VV, Grady WM (2011) Epigenetics and colorectal cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 8: Issa JP, Vertino PM, Wu J, Sazawal S, Celano P, Nelkin BD, Hamilton SR, Baylin SB (1993) Increased cytosine DNA-methyltransferase activity during colon cancer progression. J Natl Cancer Inst 85: Casillas MA, Jr, Lopatina N, Andrews LG, Tollefsbol TO (2003) Transcriptional control of the DNA methyltransferases is altered in aging and neoplastically-transformed human fibroblasts. Mol Cell Biochem 252: Ogino S, Cantor M, Kawasaki T, Brahmandam M, Kirkner GJ, Weisenberger DJ, Campan M, Laird PW, Loda M, Fuchs CS (2006) CpG island methylator phenotype (CIMP) of colorectal cancer is best characterised by quantitative DNA methylation analysis and prospective cohort studies. Gut 55: Weisenberger DJ, Siegmund KD, Campan M, Young J, Long TI, Faasse MA, Kang GH, Widschwendter M, Weener D, Buchanan D, Koh H, Simms L, Barker M, Leggett B, Levine J, Kim M, French AJ, Thibodeau SN, Jass J, Haile R, Laird PW (2006) CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nat Genet 38: Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, Kraft P, Loda M, Fuchs CS (2007) Evaluation of markers for CpG island methylator phenotype (CIMP) in colorectal cancer by a large population-based sample. J Mol Diagn 9: Kaneda A, Yagi K (2011) Two groups of DNA methylation markers to classify colorectal cancer into three epigenotypes. Cancer Sci 102: Park SJ, Rashid A, Lee JH, Kim SG, Hamilton SR, Wu TT (2003) Frequent CpG island methylation in serrated adenomas of the colorectum. Am J Pathol 162: Weisenberger DJ, Trinh BN, Campan M, Sharma S, Long TI, Ananthnarayan S, Liang G, Esteva FJ, Hortobagyi GN, McCormick F, Jones PA, Laird PW (2008) DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital MethyLight. Nucleic Acids Res 36: Tanaka N, Huttenhower C, Nosho K, Baba Y, Shima K, Quackenbush J, Haigis KM, Giovannucci E, Fuchs CS, Ogino S (2010) Novel application of structural equation modeling to correlation structure analysis of CpG island methylation in colorectal cancer. Am J Pathol 177: Ang PW, Loh M, Liem N, Lim PL, Grieu F, Vaithilingam A, Platell C, Yong WP, Iacopetta B, Soong R (2010) Comprehensive profiling of DNA methylation in colorectal cancer reveals subgroups with distinct clinicopathological and molecular features. BMC Cancer 10: Shen L, Toyota M, Kondo Y, Lin E, Zhang L, Guo Y, Hernandez NS, Chen X, Ahmed S, Konishi K, Hamilton SR, Issa JP (2007) Integrated genetic and epigenetic analysis identifies three different subclasses of colon cancer. Proc Natl Acad Sci USA 104: Minoo P, Moyer MP, Jass JR (2007) Role of BRAF-V600E in the serrated pathway of colorectal tumourigenesis. J Pathol 212: Gazin C, Wajapeyee N, Gobeil S, Virbasius CM, Green MR (2007) An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature 449: Yi J, Wang ZW, Cang H, Chen YY, Zhao R, Yu BM, Tang XM (2001) p16 gene methylation in colorectal cancers associated with Duke s staging. World J Gastroenterol 7: Umetani N, Takeuchi H, Fujimoto A, Shinozaki M, Bilchik AJ, Hoon DS (2004) Epigenetic inactivation of ID4 in colorectal carcinomas correlates with poor differentiation and unfavorable prognosis. Clin Cancer Res 10: Aguilera O, Fraga MF, Ballestar E, Paz MF, Herranz M, Espada J, Garcia JM, Munoz A, Esteller M, Gonzalez-Sancho JM (2006) Epigenetic inactivation of the Wnt antagonist DICKKOPF-1 (DKK-1) gene in human colorectal cancer. Oncogene 25: Chen J, Röcken C, Lofton-Day C, Schulz HU, Müller O, Kutzner N, Malfertheiner P, Ebert MP (2005) Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis. Carcinogenesis 26: Issa JP, Ottaviano YL, Celano P, Hamilton SR, Davidson NE, Baylin SB (1994) Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nature Genetics 7: Wendt MK, Johanesen PA, Kang-Decker N, Binion DG, Shah V, Dwinell MB (2006) Silencing of epithelial CXCL12 expression by DNA hypermethylation promotes colonic carcinoma metastasis. Oncogene 25: McGough JM, Yang D, Huang S, Georgi D, Hewitt SM, Röcken C, Tänzer M, Ebert MPA, Liu K (2008) DNA methylation represses IFNγ-induced and signal transducer and activator of transcription 1-mediated IFN regulatory factor 8 activation in colon carcinoma cells. Mol Cancer Res 6: Yang D, Thangaraju M, Greeneltch K, Browning DD, Schoenlein PV, Tamura T, Ozato K, Ganapathy V, Abrams SI, Liu K (2007) Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer Res 67: Patra SK, Bettuzzi S (2007) Epigenetic DNA-methylation regulation of genes coding for lipid raft-associated components: A role for raft proteins in cell transformation and cancer progression. Oncol Rep 17: Ikeguchi M, Makino M, Kaibara N (2001) Clinical significance of E- -cadherin-catenin complex expression in metastatic foci of colorectal carcinoma. J Surg Oncol 77: Sunami E, de Maat M, Vu A, Turner RR, Hoon DS (2011) LINE-1 hypomethylation during primary colon cancer progression. PLoS One 6: e Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, Kawasaki T, Chan AT, Schernhammer ES, Giovannucci EL, Fuchs CS (2008) A cohort study of tumoral LINE- 1 hypomethylation and prognosis in colon cancer. J Natl Cancer Inst 100: Ahn JB, Chung WB, Maeda O, Shin SJ, Kim HS, Chung HC, Kim NK, Issa JP (2011) DNA methylation predicts recurrence from resected stage III proximal colon cancer. Cancer 117: Dimberg J, Ström K, Löfgren S, Zar N, Lindh M, Matussek A (2012) DNA promoter methylation status and protein expression of interleukin-8 in human colorectal adenocarcinomas. Int J Colorectal Dis 27: Migheli F, Migliore L (2012) Epigenetics of colorectal cancer. Clin Genet 81: Duthie SJ (2011) Folate and cancer: how DNA damage, repair and methylation impact on colon carcinogenesis. J Inherit Metab Dis 34: Mason JB, Dickstein A, Jacques PF, Haggarty P, Selhub J, Dallal G, Rosenberg IH (2007) A temporal association between folic acid fortification and an increase in colorectal cancer rates may be illuminating important biological principles: a hypothesis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: Coppedè F (2011) Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Lett [Epub ahead of print] 278

13 95. Krook JE, Moertel CG, Gunderson LL, Wieand HS, Collins RT, Beart RW, Kubista TP, Poon MA, Meyers WC, Mailliard JA, Twito DI, Morton RF, Veeder MH, Witzig TE, Cha S, Vidyarthi SC (1991) Effective surgical adjuvant therapy for high-risk rectal carcinoma. N Engl J Med 324: Itzkowitz SH, Jandorf L, Brand R, Rabeneck L, Schroy PC, Sontag S, Johnson D, Skoletsky J, Durkee K, Markowitz S, Shuber A (2007) Improved fecal DNA test for colorectal cancer screening. Clin Gastroenterol Hepatol 5: Chen WD, Han ZJ, Skoletsky J, Olson J, Sah J, Myeroff L, Platzer P, Lu S, Dawson D, Willis J, Pretlow TP, Lutterbaugh J, Kasturi L, Willson JK, Rao JS., Shuber A, Markowitz SD (2005) Detection in fecal DNA of colon cancer-specific methylation of the nonexpressed vimentin gene. J Natl Cancer Inst 97: Kim MS, Lee J, Sidransky D (2010) DNA methylation markers in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev 29: Role of DNA methylation in colorectal cancer Paulina Tokarz *, Janusz Blasiak Faculty of Biology and Environmental Protection, Department of Molecular Genetics, University of Lodz, 141/143 Pomorska St., Lodz, Poland * ptokarz@biol.uni.lodz.pl Key words: adenoma, adenocarcinoma, colorectal cancer, CpG island methylator phenotype, DNA methylation, epigenetic changes, malignant transformation Abstract Epigenetic changes, including DNA methylation, influence the structure of chromatin, gene expression and genomic stability. It appears that the abnormal pattern of DNA methylation may be important in pathological conditions, including colorectal cancer. The most common pathway leading to this tumor is adenoma-carcinoma sequence. It was reported that during this process changes in the pattern of DNA methylation occurred, but the question whether these changes are the causes of neoplastic transformation of colorectal cancer or the consequences of pathological changes in the cancer cells is still open. Thus, changes in DNA methylation pattern may influence the pathogenesis of colorectal cancer but this hypothesis has not been confirmed experimentally and there is a need for research determining the relationship between changes in DNA methylation profile and colorectal cancer. By analyzing methylation of DNA sequences a molecular subgroup of this tumor has been distinguished. It is characterized by a high frequency of methylation of genes and it was denoted CpG islands methylator phenotype (CIMP). Changes in the pattern of DNA methylation are used as molecular markers for diagnosis and screening of colorectal cancer. A better understanding of changes in DNA methylation in colorectal cancer may help to facilitate prognosis and prediction of the disease and to improve its diagnosis. Postępy Biochemii 59 (3)