(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA03/001061

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 38/50 ( ) A61K 47/48 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka (73) Uprawniony z patentu: HELIX BIOPHARMA CORP., Aurora, CA (30) Pierwszeństwo: , US, 60/397,244 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (72) Twórca(y) wynalazku: HEMAN CHAO, Aurora, CA WAH WONG, Edmonton, CA DONALD SEGAL, Stouffville, CA JERRY MCELROY, Richmond Hill, CA JOHN DOCHERTY, Aurora, CA JODI DICKSTEIN, Markham, CA (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Sebastian Walkiewicz

2 2 PL B1 Opis wynalazku Odnośniki do pokrewnych zgłoszeń Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo i korzysta z warunkowego zgłoszenia amerykańskiego o nr kolejnym 60/397, 244, zgłoszonym 18 Iipca 2002, którego ujawnienie jest włączone tutaj w całości jako odnośnik w każdym odniesieniu. Dziedzina wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do zastosowania w leczeniu raka. Podstawa wynalazku Rak jest powodem jednej piątej całej śmiertelności w Stanach Zjednoczonych i jest drugą wiodącą przyczyną raka. Rak typowo charakteryzuje się niekontrolowanymi podziałami komórek w populacji. Te niekontrolowane podziały mogą dotyczyć komórek krwi, takich jak różne typy limfocytów, lub komórek które agregują lub naturalnie występują w danej tkance lub organie, np. guzy lite, takie jak wtórne lub pierwotne guzy sutka, wątroby, przełyku, żołądka, jelit, mózgu, kości, lub prostaty. Proponowano wiele różnych typów terapii raka. Terapie te ogólnie obejmują chirurgiczne usunięcie guzów litych, terapię naświetlaniem, takim jak promieniowanie X, chemoterapię, terapię immunologiczną i terapię genową. Rodzaje terapii, które są wybrane dla danej postaci raka będą zależeć od takich czynników jak wiek pacjenta, poziom umiejscowienia i rodzaj raka, i stadium raka. Często terapia będzie wymagać połączenia dwóch lub więcej odmian terapii, takich jak terapia promieniowaniem X w połączeniu z chemoterapią, lub terapia immunologiczna w połączeniu z chemoterapią. W leczeniu różnych typów raka stosuje się wiele chemoterapeutycznych związków i kompozycji, jak i strategii. Wiele przeciwnowotworowych związków zaprojektowano tak, aby przerwać replikację w komórkach, w których szybko zachodzą podziały, lub aby hamować kluczowe połączenia metaboliczne w komórkach aktywnie namnażających się. Pomimo, że stosując takie rozwiązania osiągnięto pewien poziom sukcesu w przypadkach pewnych typów raka, lub w przypadku raka na pewnych etapach, chemoterapia jest ogólnie związana z nieprzyjemnymi, do wyniszczających, szkodliwych działaniach ubocznych, takich jak złe samopoczucie, nudności, utrata apetytu, łysienie i anemia. Ponadto, związki które działają na poziomie replikacji komórkowej, zarówno poprzez wprowadzenie analogów nukleotydów do dzielących się komórek lub przez przerywanie normalnej replikacji, skutecznie wprowadzają szeroko rozprzestrzeniające się mutacje genetyczne do normalnych komórek w organizmie pacjenta. Ponadto, komórki rakowe mogą rozwinąć oporność na wiele rodzajów przeciwnowotworowych środków, zarówno przez ograniczenie pobierania środka przez komórki rakowe jak i przez zmianę metabolizmu środka w obrębie komórek. W odpowiedzi na te ograniczenia, próbowano zmodyfikować chemoterapeutyczne środki aby zmniejszyć ich działania uboczne, przezwyciężyć problemy związane z opornością, lub poprawić ich działanie w danym, docelowym miejscu występowania guza. Podczas gdy te wysiłki prowadziły do uzyskania ulepszonych środków terapeutycznych w pewnych przypadkach, pozostaje potrzeba dostarczenia ulepszonych chemoterapeutycznych środków i sposobów. Zwłaszcza, taki środek powinien być skuteczny w zabijaniu lub hamowaniu wzrostu komórek rakowych, powinien być stosunkowo nietoksyczny zarówno w odniesieniu do działań ubocznych, jak i długoterminowego zachowania integralności genetycznej u leczonego osobnika, i korzystnie powinien być dostarczany w postaci, która umożliwia bezpośrednie wprowadzenie do guza lub selektywne dotarcie do guza. Podsumowanie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka charakteryzującą się tym, że zawiera ureazę ugrupowanie naprowadzające, sprzężone z ureazą, wybrane z grupy składającej się z przeciwciała przeciwko antygenowi przeciwrakowemu, przeciwciała anty-hcg i Iigandu zdolnego do specyficznego wiązania z receptorami powierzchniowymi komórek raka, przy czym to ugrupowanie naprowadzające poprawia dostarczanie enzymu do komórki rakowej po podaniu kompozycji pacjentowi; oraz nośnik farmaceutyczny. Korzystnie, kompozycja zawiera białko fuzyjne ugrupowania naprowadzającego i ureazy. Korzystnie, ureaza jest ureazą roślinną lub bakteryjną. Korzystnie, kompozycja zawiera również słabo zasadowy środek przeciwnowotworowy, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient ph w guzie litym. Korzystnie, środek przeciwnowotworowy jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomycyny, alkaloidów Vinca takich, jak winbla-

3 PL B1 3 styna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy i przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny. Korzystnie, kompozycja przeznaczona jest do leczenia guza litego u ssaka leczonego przeciwnowotworowym związkiem słabo zasadowym, którego efektywność jest obniżona przez niższy wewnątrzkomórkowy/wyższy zewnątrzkomórkowy gradient ph w guzie litym. Korzystnie, przeciwnowotworowy związek jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomicyny, alkaloidów Vinca takich jak winblastyna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy oraz przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku stosowana jest do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Gdy ugropowanie naprowadzające jest polipeptydem, kompozycja może stanowić białko fuzyjne złożone z ugrupowania naprowadzającego i enzymu ureazy. W innym rozwiązaniu, ureaza może obejmować, na swoim końcu C- lub N-, jeden peptyd tworzący zwój (coil-forming peptide) charakteryzujący się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziaływania z drugim, przeciwnie naładowanym peptydem tworzącym zwój, tworząc stabilny heterodimer zwinięty w α-helisowy solenoid (coiled-coil); α cząstka chemiczna może zawierać ugrupowanie naprowadzające, które obejmuje drugi peptyd tworzący zwój. Enzym ureazy może być również zamknięty w pęcherzykach. Przykładowe pęcherzyki obejmują liposomy, które długo krążą w organizmie dzięki powłoce zewnętrznej z łańcuchów poli(glikolu etylenowego) i mają taką wielkość, aby mogły przechodzić poza naczynie do okolic guza, gdy kompozycja jest podawana dożylnie; i liposomy mające związane na powierzchni ugrupowania naprowadzające. Pęcherzyki mogą zawierać dodatkowe środki, takie jak mocznik, aktywny terapeutycznie środek przeciwnowotworowy lub środek obrazujący. Cząstka chemiczna może obejmować związany z nią inhibitor ureazy, w ilości dostatecznej aby hamować aktywność tego enzymu. Wynalazek może być stosowany w sposobie hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Sposób obejmuje działanie na komórki ureazą w ilości skutecznej, aby hamować wzrost komórek rakowych. Gdy komórki rakowe stanowią guz lity, ureaza może być podana przez wstrzykiwanie bezpośrednio do guza u osobnika, lub przez pozajelitowe podawanie, np. iniekcję, inne niż podawanie bezpośrednie. Oprócz ureazy w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku do stosowania według wynalazku, odpowiednie są różne kompozycje zawierające ureazę, wymienione powyżej. Sposób może obejmować regulowanie aktywności ureazy w komórkach rakowych przez podawanie osobnikowi, ilości inhibitora ureazy skutecznej do obniżenia aktywności ureazy w tych komórkach rakowych. Aktywność ureazy może być regulowana przeciwnie przez podawanie mocznika osobnikowi, przed, w czasie, lub po podawaniu ureazy. Ureaza może być podawana w dwóch etapach: pierwszy etap obejmuje koniugat ugrupowania naprowadzającego na guz z pierwszą wiążącą częścią cząsteczki mającą zdolność do oddziaływania z drugą częścią wiążącą; i drugi koniugat w drugim etapie, zawierający drugą wiążącą część cząsteczki sprzężoną z ureazą. W jeszcze innym rozwiązaniu, sposób może obejmować podawanie osobnikowi, kompozycji do terapii genowej złożonej z ukierunkowanego wektora skutecznego, gdy jest podawany osobnikowi, do selektywnej transfekcji komórek rakowych i niesionej przez ten wektor, zrekombinowanej sekwencji kwasu nukleinowego skutecznej do wytwarzania mrna kodującego ureazę w transfekowanych komórkach rakowych. Przykładowym wektorem jest adenowirus. Przykładowa sekwencja kwasu nukleinowego koduje ureazę i wydzielniczą sekwencję liderową skuteczną do wzmacniania wydzielania ureazy z transfekowanych komórek rakowych. Wynalazek może również być stosowany do zwiększania skuteczności terapeutycznej słabo zasadowego przeciwnowotworowego związku, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient ph w guzie litym, u osobnika otrzymującego środek do leczenia guza. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi ilości ureazy skutecznej do obniżania lub odwracania wyższego wewnątrzkomórkowego/niższego zewnątrzkomórkowego gradientu ph w guzie litym.

4 4 PL B1 Korzystnie, ilość ureazy podawana jest skuteczna do podniesienia wartości ph zewnątrzkomórkowego płynu w guzie do ph przynajmniej 7,2. Ureaza może być podana przez wstrzykiwanie bezpośrednio do guza, lub przez pozajelitowe podawanie inne niż podawanie bezpośrednie, jak powyżej. Przeciwnowotworowym związkiem może być, na przykład, doksorubicyna, daunorubicyna, mitoksantron, epirubicyna, mitomycyna, bleomycyna, alkaloidy Vinca, takie jak winblastyna i winkrystyna, środki alkilujące, takie jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy, jak i przeciwnowotworowe pochodne puryny lub pirymidyny. Wynalazek może być również użyteczny w określaniu obecności, wielkości lub stanu guza litego u osobnika. W tym zastosowaniu, ureaza jest podawana osobnikowi mającemu, lub u którego podejrzewa się guz lity, w warunkach skutecznych do zlokalizowania ureazy w guzie litym u pacjenta. Osobnik następnie jest badany narzędziami diagnostycznymi, takimi jak fluoroskopia, MRI, lub komputerowa tomografia emisyjna, zdolnymi do wykrywania zmian w tkance osobnika zewnątrzkomórkowego ph, zarówno w obecności lub bez środka znacznikowego czułego na zmianę ph, w celu identyfikacji regionu tkanki u pacjenta, która wykazuje wzrost wartości zewnątrzkomórkowego ph. Sposób ten może być stosowany w połączeniu z powyżej opisanym sposobem leczenia, mając na celu wyznaczenie zakresu i/lub skuteczności dawkowania lub leczenie z użyciem ureazy. Zatem, na przykład, w podawaniu ureazy osobnikowi, zakres i stopień zmian ph w obszarze guza mogą być monitorowane, co umożliwi poprowadzenie podawania ureazy, lub aby wyznaczyć zmiany w wielkości guza lub zakresu w czasie leczenia. Ujawniono również zestaw stosowany do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Zestaw obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą enzym ureazy i materiały instruktażowe określające podawanie kompozycji osobnikowi, do leczenia raka u pacjenta. Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie kompozycji z ureazą osobnikowi w ilości, która zależy od wielkości guza i stanowi od 0,1 do 100 jednostek międzynarodowych, korzystnie 0,5 do 10, aktywność ureazy na mm 3 guza, gdy kompozycja jest podawana przez bezpośrednią iniekcję do guza, a w ilości od jednostek międzynarodowych/kg, korzystnie jednostek międzynarodowych/kg jednostek międzynarodowych aktywności ureazy/kg masy ciała osobnika, gdy kompozycja jest podawana osobnikowi pozajelitowo, inaczej niż przez bezpośrednią iniekcję do guza. Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie ureazy osobnikowi, który również otrzymuje słabo zasadowy przeciwnowotworowy związek, którego skuteczność jest obniżona przez wysoki wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient ph w guzie litym, w ilości ureazy skutecznej do obniżania lub odwracania wysokiego wewnątrzkomórkowego/niższego zewnątrzkomórkowego gradientu ph w guzie litym. Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie ureazy osobnikowi, u którego występuje, lub u którego podejrzewa się występowanie guza litego, w warunkach skutecznych do zlokalizowania ureazy w guzie litym u pacjenta, badanie osobnika środkami diagnostycznymi do wykrywania zmiany zewnątrzkomórkowego ph w tkance osobnika i zidentyfikowanie obszaru tkanki u pacjenta, który wykazuje podwyższenie zewnątrzkomórkowe ph po podawaniu leku. Ujawniona jest również kompozycja do terapii genowej stosowana do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Kompozycja ta obejmuje, jak zauważono powyżej, naprowadzający wektor skuteczny, gdy jest podawany osobnikowi, do selektywnej transfekcji komórek rakowych, i niesioną przez ten wektor, zrekombinowaną sekwencję kwasu nukleinowego skuteczną do wytwarzania mrna kodującego ureazę w transfekowanych komórkach rakowych. Te i inne przedmioty, i cechy wynalazku będą bardziej zrozumiałe, po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku w połączeniu z załączonymi rysunkami. Krótki opis rysunku Fig. 1A-1D ilustrują etapy reakcji ureazy. Mocznik jest cięty przez ureazę do utworzenia jednej cząsteczki amoniaku i jednej karbaminianu (A). Karbaminian spontanicznie rozkłada się na amoniak i kwas węglowy (B). Kwas węglowy ulega równoważeniu w wodzie (C), podobnie jak dwie cząsteczki amoniaku, które ulegają protonowaniu, co prowadzi do utworzenia jonów amonowego i wodorotlenkowego (D). Reakcja prowadzi do podwyższenia wartości ph w środowisku reakcji; Fig. 2 przedstawia uzyskany techniką spektrometrii mas profil nieoczyszczonej próbki zawierającej ureazę, wytworzoną zgodnie z jednym wariantem wynalazku;

5 PL B1 5 Fig. 3 przedstawia wyniki oczyszczania ureazy z wykorzystaniem powinowactwa, w czasie różnych etapów procesu oczyszczania, zgodnie z innym wariantem wynalazku; Fig. 4 przedstawia oczyszczanie koniugatu E-zwój-αhEGFR IgG z zastosowaniem kolumny z białkiem G, wytworzonego zgodnie z jednym wariantem wynalazku oraz Fig. 5 przedstawia miano przeciwciała oczyszczonego koniugatu E-zwój-αhEGFR IgG wytworzonego zgodnie z jednym wariantem wynalazku jak wyznaczono stosując ELISA z unieruchomionym K-zwojem. Szczegółowy opis wynalazku I. Definicje Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy stosowane w niniejszym zgłoszeniu mają takie samo znaczenie jak je rozumie biegły w dziedzinie niniejszego wynalazku. Osobom realizującym niniejszy wynalazek szczególnie polecany jest podręcznik Sambrooka i wsp (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, wyd. 3.; i Ausubela, F. M., i wsp. (1993) w Current Protocols in Molecular Biology, gdzie znajdują się definicje i określenia z tej dziedziny. Zrozumiałe jest, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do opisanej szczególnej metodyki, protokołów i odczynników, gdyż mogą być one różne. Określenie "ureaza" odnosi się do enzymu mającego enzymatyczną aktywność amidohydrolazy mocznikowej (E.C. 3,5,1,5), zarówno występującej naturalnie jak i otrzymywanej z wykorzystaniem np. technik rekombinacji kwasu nukleinowego i/lub syntezy chemicznej. Termin ureaza również obejmuje białka fuzyjne zawierające całą ureazę, jej podjednostki, lub jej fragmenty i/lub ureazę z aminokwasowymi podstawieniami, delecjami lub addycjami, która zachowuje aktywność amidohydrolazy mocznikowej polipeptydu. Skrócona sekwencja ureazy jak stosowano tutaj jest fragmentem ureazy, która jest pozbawiona części niezmienionej sekwencji ureazy rozpoczynającej się na końcu aminowym lub karboksylowym ureazy. Sposoby wyodrębnienia natywnej ureazy, rekombinowanego syntetyzowania ureazy i identyfikacji fragmentów aktywnych, i zmodyfikowanych polipeptydów ureazy przedstawiono poniżej. Określenie "rak (nowotwór)" ma odnosić się do nieprawidłowej komórki lub komórek, lub masy tkanki. Wzrost tych komórek lub tkanek jest nadmierny i jest nieskoordynowany w porównaniu do normalnych tkanek lub komórek, i trwa w ten sam nadmierny sposób po zaprzestaniu bodźców, które wywołują zmianę. Te nowotworowe tkanki lub komórki wykazują brak organizacji strukturalnej i koordynacji względem normalnych tkanek lub komórek, co może prowadzić do masy tkanek lub komórek, które mogą być zarówno łagodne lub złośliwe. Jak stosowano tutaj, rak obejmuje dowolny nowotwór. Objęte są, lecz nie ograniczając zakresu, czerniak, gruczalakorak, złośliwy glejak, rak gruczołu krokowego, rak nerek, rak pęcherza, rak trzustki, rak tarczyczy, rak płuc, rak okrężnicy, rak odbytu, rak mózgu, rak wątroby, rak sutka, rak jajnika i tym podobne. "Guz" lub "guz lity" odnosi się do wspólnej masy komórek rakowych, obejmując lecz nie ograniczając zakresu, guzy półstałe i guzy lite, przerzuty guzów litych, naczyniakowłókniaki, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, naczyniak krwionośny i mięsak Kaposiego. Jak stosowano tutaj określenie "ugrupowanie naprowadzające" odnosi się do cząsteczki, która wiąże się ze zdefiniowaną populacją komórek lub wybranym typem komórek. Ugrupowanie naprowadzające może wiązać receptor, oligonukleotyd, substrat enzymatyczny, determinantę antygenową, lub inne wiążące miejsce obecne na lub w docelowej komórce lub populacji komórek. Przykładowym ugrupowaniem naprowadzającym jest przeciwciało. Sekwencje fragmentów przeciwciała i małych peptydów zdolne do rozpoznawania ulegających ekspresji antygenów są również rozważane jako ugrupowania naprowadzające. Jak stosowano tutaj, określenie "hamuje wzrost komórek rakowych" lub "hamowanie wzrostu komórek raka" odnosi się do dowolnego spowolnienia szybkości proliferacji i/lub migracji komórek raka, zatrzymania proliferacji i/lub migracji komórek raka, lub zabicia komórek rakowych, tak że szybkość wzrostu komórek rakowych jest obniżona w porównaniu z obserwowaną lub przewidywaną szybkością wzrostu w przypadku nietraktowanych, kontrolnych komórek raka. Określenie "hamuje wzrost" może również odnosić się do zmniejszenia wielkości lub zniknięcia komórek raka lub guza, jak i do zmniejszenia jego skłonności do przerzutów. Korzystnie, takie hamowanie na poziomie komórkowym może obniżać wielkość, powstrzymywać wzrost, zmniejszać agresywność, lub zapobiegać lub hamować przerzuty raka u pacjenta. Osoby biegłe w tej dziedzinie mogą z łatwością określić, dowolnym z wielu odpowiednich wskaźników, czy wzrost komórek raka został zahamowany.

6 6 PL B1 Hamowanie wzrostu komórek raka może być udowodnione, na przykład, przez wykazanie zatrzymania komórek rakowych w danej fazie cyklu komórkowego, np. zatrzymanie w fazie G2/M cyklu komórkowego. Hamowanie wzrostu komórek raka może być również wykazane przez bezpośredni lub pośredni pomiar wielkości komórek raka lub guza. U pacjentów będących ludźmi, cierpiących na raka, takie pomiary ogólnie są wykonywane stosując dobrze znane sposoby obrazowania, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego, obrazowanie metodą osiowej tomografii komputerowej i promieniami X. Wzrost komórek raka może być również wyznaczony pośrednio, na przykład przez oznaczanie poziomów krążącego antygenu rakowo płodowego, antygenu specyficznego dla prostaty lub innych antygenów specyficznych dla danego typu raka, które są skorelowane ze wzrostem komórek raka. Hamowanie wzrostu raka jest również ogólnie skorelowane z przedłużonym przeżyciem i/lub poprawą zdrowia i dobrym samopoczuciem pacjenta. Jak stosowano tutaj, określenie "indukuje apoptozę" odnosi się do doprowadzenia do postaci programowanej śmierci komórki charakteryzującej się fragmentacją DNA. Apoptoza może być określona sposobami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, na rynku dostępne są zestawy, które wykrywają obecność pofragmentowanego DNA z wykorzystaniem immunohistochemii in situ (np. Apoptag, dostępny z Intergen, Purchase, N. Y.). Dodatkowo, apoptoza może być również wyznaczona poprzez analizę FACS, w której apoptotyczne komórki wykazują obecność DNA asub-g1, co wskazuje na fragmentację DNA. Jak stosowano tutaj, termin "przeciwciało" odnosi się do peptydu, polipeptydu, lub białka zawierającego jeden lub więcej peptydy lub polipeptydy zasadniczo lub częściowo kodowane przez przynajmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunoglobuliny lub gen kodujący immunoglobuliny lub fragment przynajmniej jednej cząsteczki immunoglobuliny lub genu kodującego immunoglobulinę. Rozpoznane geny immunoglobulin obejmują geny stałych regionów kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon i mi, jak i wiele (10 4 ) genów zmiennych regionów immunoglobulin. Lekkie łańcuchy są sklasyfikowane bądź jako kappa lub jako lambda. Ciężkie łańcuchy są sklasyfikowane jako gamma, mi, alfa, delta, lub epsilon, które z kolei definiują klasy immunoglobulin odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Typowa immunoglobulinowa (np. przeciwciało) jednostka strukturalna obejmuje tetramer. Każdy tetramer złożony jest z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, każda para ma jeden "lekki" łańcuch (około 25 kd) i jeden "ciężki" łańcuch (około kd). Koniec N każdego łańcucha definiuje region zmienny o około 100 do 110 lub więcej aminokwasów głównie odpowiedzialny z rozpoznawanie antygenu. Określenia "zmienny lekki łańcuch" (VL) oraz "zmienny ciężki łańcuch" (VH) odnoszą się odpowiednio do lekkich i ciężkich łańcuchów. Przeciwciała występują jako niezmienione immunoglobuliny lub jako wiele dobrze scharakteryzowanych fragmentów wytwarzanych w wyniku trawienia różnymi peptydazami. Zatem, na przykład, pepsyna trawi przeciwciało poniżej wiązań dwusiarczkowych w regionie zgięcia tworząc F(ab)'2, dimer Fab, który sam jest lekkim łańcuchem połączonym z VH-CH1 wiązaniem dwusiarczkowym. F(ab)'2 może ulec redukcji w łagodnych warunkach do zniesienia wiązań dwusiarczkowych w regionie zgięcia, przez co dimer (Fab')2 ulega przekształceniu w monomer Fab'. Monomer Fab stanowi zasadniczo Fab z częścią regionu zgięcia (patrz Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993), zawierający bardziej szczegółowy opis innych fragmentów przeciwciała). Podczas gdy różne fragmenty przeciwciała są zdefiniowane w odniesieniu do trawienia nieuszkodzonego przeciwciała, osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie doceni, że takie fragmenty Fab' mogą być syntetyzowane de novo zarówno chemicznie jak i przez zastosowanie technologii rekombinacji DNA. Zatem, termin "przeciwciało", jak stosowano tutaj, również obejmuje fragmenty przeciwciała zarówno wytwarzane przez modyfikację całego przeciwciała lub zsyntetyzowane de novo stosując technologie rekombinacji DNA. Przeciwciała obejmują pojedynczy łańcuch przeciwciała, włącznie z przeciwciałami o pojedynczym łańcuchu Fv (sfv), w których VH i VL są połączone razem (bezpośrednio lub przez łącznik peptydowy) aby utworzyć jednolity polipeptyd. "Fragment wiążący antygen" przeciwciała jest peptydowym lub polipeptydowym fragmentem przeciwciała, który wiąże się z antygenem. Miejsce wiążące antygen jest tworzone przez te aminokwasy przeciwciała, które biorą udział, lub są zaangażowane lub wpływają na wiązanie antygenu. Patrz Scott, T. A. i Mercer, E. I., Concise encyclopedia: biochemistry and molecular biology (de Gruyter, 3d ed. 1997) i Watson, J. D. i wsp., Recombinant DNA (2d ed. 1992), z których każda jest włączona tutaj jako odnośnik w całości w każdym odniesieniu. Określenie "fragment przeciwciała" również obejmuje dowolne syntetyczne lub uzyskane metodami inżynierii genetycznej białko, które ma aktywność taką jak przeciwciało przez wiązanie ze specyficznym antygenem, tworząc kompleks.

7 PL B1 7 Określenia "środek aktywny", "lek" oraz "środek aktywny farmakologicznie" są stosowane wymiennie i odnoszą się do chemicznego materiału lub związku który, gdy jest podawany osobnikowi indukuje żądany skutek farmakologiczny i ma obejmować środek diagnostyczny lub terapeutyczny, włącznie z radioizotopami, lekami, środkami przeciwnowotworowymi, toksynami i tym podobnymi. Korzystnie, określenie środek aktywny obejmuje białka, glikoproteiny, naturalne i syntetyczne peptydy, alkaloidy, polisacharydy, cząsteczki kwasu nukleinowego, małe cząsteczki i tym podobne. Korzystniej, określenie środek aktywny odnosi się białek. Przykładowym środkiem aktywnym jest ureaza. Termin środek aktywny "wrażliwy na ph" odnosi się do środka aktywnego, którego zdolność do indukcji żądanego działania farmakologicznego zależy od, przynajmniej w części, od ph otaczającego zewnątrzkomórkowego środowiska. Określenie "środek oczyszczający (usuwający)", jak stosowano tutaj, odnosi się do środka zdolnego do wiązania, kompleksowania lub w inny sposób łączenia się z podawaną częścią cząsteczki, np. ugrupowanie naprowadzające - ligand, ugrupowanie naprowadzające-anty-ligand lub sam antyligand, obecną w krwioobiegu osobnika, któremu jest podawany, dzięki czemu usunięcie (klirens) części cząsteczki z krwioobiegu ciała osobnika, który ją otrzymał jest ułatwiony, podobnie jak usuwanie z krwioobiegu, lub jego inaktywacja w krwioobiegu. Środek oczyszczający jest korzystnie charakteryzowany fizycznymi właściwościami, takimi jak wielkość, ładunek, konfiguracja lub ich skład, które ograniczają dostęp środka oczyszczającego do populacji docelowych komórek rozpoznawanych przez ugrupowanie naprowadzające stosowane według tego samego protokołu leczenia jak środek oczyszczający. Określenie "środek obrazujący" ma odnosić się do związków, które mogą być wykrywane. Termin "adiuwant" odnosi się do substancji lub środka dodawanego do preparatu lub kompozycji, aby wspomóc działanie głównego składnika. Terminy płyn "tkankowy" oraz "zewnątrzkomórkowy" odnoszą się do płynu znajdującego się między zanurzonymi w nim komórkami ssaków. Określenia "osobnik", "organizm pacjenta" oraz "pacjent" są tutaj stosowane wymiennie i odnoszą się do dowolnego celu leczenia. Wynalazek może być również wykorzystany w sposobie leczenia komórek guza in situ, lub w ich normalnym umiejscowieniu lub lokalizacji, na przykład nowotworowe komórki guzów sutka lub prostaty. Te guzy in situ mogą być zlokalizowane w obrębie lub na wielu różnych organizmach gospodarzy; na przykład, u ludzi, psów, kotów, koni, bydła, świń i tym podobnych. Może być leczony dowolny organizm gospodarza, w którym stwierdzono guz lub komórki guza. Osobnik zatem obejmuje kręgowca, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka. Terminem "czas pozostawania w obrębie docelowej komórki" oznaczono ilość czasu, w którym cząsteczka ureazy lub innego środka aktywnego pozostaje na powierzchni docelowej komórki lub w docelowej komórce. Jak stosowano tutaj, określenie "koniugat" obejmuje chemiczne koniugat (związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie), białka fuzyjne i tym podobne. Określenia "białko", "polipeptyd" lub "peptyd", jak stosowano tutaj, odnosi się wymiennie do biopolimerów złożonych z podjednostek aminokwasowych lub analogów aminokwasów, typowo pewne lub wszystkie z 20 typowych L-aminokwasów występujących w biologicznych białkach, związanych peptydowymi wiązaniami pomiędzy podjednostkami, lub innymi wiązaniami pomiędzy podjednostkami. Białko ma pierwszorzędową strukturę przedstawioną przez sekwencję poszczególnych podjednostek i może mieć strukturę drugorzędową helisy lub struktury pofałdowane, jak i ogólną trójwymiarową strukturę. Pomimo, że "białko" ogólnie odnosi się stosunkowo dużego polipeptydu, np. zawierającego 100 lub więcej aminokwasów, a "peptyd" odnosi się do mniejszych polipeptydów, określenia te są tutaj stosowane wymiennie. To jest, określenie "białko" może odnosić się do większego polipeptydu, jak i do mniejszego peptydu, i vice versa. Termin "modulator/regulator ureazy" oznacza zarówno inhibitor ureazy jak i środek zwiększający aktywność ureazy. Termin "inhibitor ureazy" obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek które wpływają na: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy; lub (2) jedną lub więcej normalnych funkcji ureazy. Normalne funkcje ureazy obejmują hydrolizę mocznika, prowadzącą do utworzenia karbaminianu i amoniaku. Inhibitor "działa bezpośrednio na ureazę" gdy inhibitor wiąże się z ureazą przez oddziaływania elektrostatyczne lub chemiczne. W takich oddziaływaniach mogą lub nie pośredniczyć inne cząsteczki. Inhibitor działa "pośrednio na ureazę" gdy jego najbardziej bezpośrednie działanie wpływa na cząsteczkę inną niż ureaza, która to cząsteczka wpływa na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy.

8 8 PL B1 "Środek zwiększający aktywność ureazy" obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek, która wzmacnia: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy; lub (2) jedną lub więcej normalnych funkcji ureazy. Środek zwiększający aktywność działa "pośrednio na ureazę" gdy jego najbardziej bezpośrednie działanie wpływa na cząsteczkę inną niż ureaza, która to cząsteczka wpływa na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy. Termin "zaprojektowana mutacja" w genie kodującym ureazę, obejmuje zmiany w sekwencji nukleotydowej genu kodującego ureazę, która prowadzi do utworzenia 1) zwiększonej lub obniżonej ilości białka ureazy względem ilości wytwarzanej przy braku takiej zmiany; lub (2) białko ureazy mające zwiększone lub uszkodzone normalne funkcjonowanie względem takiego samego funkcjonowania bez takiej zmiany. Termin "kompozycja farmaceutyczna" oznacza kompozycję odpowiednią do zastosowania farmaceutycznego u osobnika, obejmującego zwierzę lub człowieka. Kompozycja farmaceutyczna ogólnie obejmuje skuteczne ilości środka aktywnego i nośnik, obejmujący, np. farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Termin "farmaceutycznie dopuszczalny preparat" obejmuje preparat, który jest odpowiedni do podawania środka aktywnego (np. ureazy lub modulatora ureazy) w sposób, który prowadzi do żądanych wyników i nie wytwarza żadnych dodatkowych szkodliwych działań ubocznych, dostatecznych aby przekonać lekarza, że ewentualna szkoda dla pacjenta jest większa niż ewentualna korzyść dla pacjenta. Podstawowym składnikiem do preparatu do iniekcji jest typowo nośnik wodny. Nośniki będące roztworami wodnymi, które są użyteczne obejmują roztwór chlorku sodu (NaCI), roztwór Ringera, roztwór NaCI/dekstroza i tym podobne. Mieszające się z wodą nośniki są również użyteczne do uzyskania pełnej rozpuszczalności środka aktywnego. Środki przeciwbakteryjne, bufory i przeciwutleniacze mogą być użyteczne, w zależności od potrzeby. Podobnie, "farmaceutycznie dopuszczalna sól "farmaceutycznie dopuszczalna" pochodna związku, jak określono tutaj, jest solą lub inną pochodną, która nie jest biologicznie lub w inny sposób niepożądana. Określenie "kontrolowane uwalnianie" ma odnosić się do dowolnego preparatu zawierającego lek, w którym sposób i profil uwalniania leku z preparatu są kontrolowane. Określenie "kontrolowane uwalnianie" odnosi się do preparatów o natychmiastowym jak i nie natychmiastowym uwalnianiu, w przypadku preparatów o nienatychmiastowym uwalnianiu obejmują one, lecz nie ograniczając zakresu, preparat o przedłużonym uwalnianiu i opóźnionym uwalnianiu. Określenie "przedłużone uwalnianie" (również określane jako "wydłużone uwalnianie") zastosowano w znaczeniu tradycyjnym i odnosi się do preparatu leku, który zapewnia stopniowe uwalnianie leku w dłuższym okresie czasu, i korzystnie, pomimo, że nie jest to konieczne, prowadzi do zasadniczo stałego poziomu leku we krwi przez dłuższy okres czasu. Określenie "opóźnione uwalnianie" zastosowano w znaczeniu tradycyjnym i odnosi się do preparatu leku, w którym występuje opóźnienie w czasie pomiędzy podaniem preparatu a uwalnianiem leku z tego preparatu. Termin "opóźnione uwalnianie" może lub nie wymagać stopniowego uwalniania leku przez dłuższy okres czasu, a zatem może lub nie być "przedłużonym uwalnianiem". Termin "traktowanie lecznicze" oznacza stosowanie leczenia u osobnika, u którego występują objawy lub znaki patologii, choroby, lub zaburzenia, przy czym leczenie stosuje się u osobnika, aby złagodzić lub usunąć te oznaki lub objawy patologii, choroby, lub zaburzenia. Termin "aktywność terapeutyczna" oznacza aktywność środka, takiego jak kwas nukleinowy, wektor, gen, polipeptyd, białko, substancja, lub ich kompozycji, które łagodzą lub usuwają znaki lub objawy patologii, choroby lub zaburzenia, gdy stosuje się u osobnika cierpiącego z powodu tych znaków lub objawów. Środek lub związek "użyteczny terapeutycznie" (np. kwas nukleinowy lub polipeptyd) wskazuje, że środek lub związek jest użyteczny w łagodzeniu, leczeniu, lub eliminacji znaków lub objawów patologii, choroby lub zaburzenia. Określenie "mała cząsteczka" obejmuje związek lub kompleks cząsteczek, zarówno syntetycznych, pochodzenia naturalnego, jak i częściowo syntetycznych, które korzystnie mają masę cząsteczkową poniżej 5000 Daltonów. Korzystniej, mała cząsteczka ma masę cząsteczkową od 100 do 1500 Daltonów. Określenia "cząsteczka kwasu nukleinowego" lub "oligonukleotyd lub ich gramatyczne równoważniki, odnoszą się tutaj do przynajmniej dwóch nukleotydów kowalencyjnie związanych razem, i typowo do cząsteczek RNA, DNA i cdna. Kwas nukleinowy korzystnie oznacza cząsteczkę jednoniciową lub dwuniciową, i będzie ogólnie zawierać wiązania fosfodiestrowe, pomimo, że w pewnych przypadkach analogi kwasu nukleinowego, mogą mieć inne szkielety zawierające, na przykład, wiąza-

9 PL B1 9 nia fosforamidowe, fosforotiolanowe, fosforoditionianowe, i/lub O-metylofosforoamidynowe. Będzie zrozumiałe, że na skutek degeneracji kodu genetycznego, może być utworzonych wiele sekwencji nukleotydowych kodujących dane peptydy, takie jak ureaza. "Heterologiczny" konstrukt lub sekwencja kwasu nukleinowego oznacza, że zawiera część sekwencji, która nie jest natywna względem komórki, w której zachodzi ekspresja. Heterologiczny, w odniesieniu do sekwencji kontrolnej, odnosi się sekwencji kontrolnej (to jest, promotora lub środka zwiększającego aktywność) który nie funkcjonuje w naturze, do regulacji ekspresji tego samego genu, który jest w tym momencie regulowany. Ogólnie, heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego nie są endogenne dla komórki lub nie są częścią genomu, w którym są one obecne, i zostały dodane do komórki, przez infekcję, transfekcję, mikroiniekcję, elektroporację, i tym podobne. Heterologiczny konstrukt kwasu nukleinowego może zawierać połączenie sekwencja kontrolna/sekwencja DNA, która jest taka sama jak, lub różna od takiego połączenia sekwencja kontrolna/sekwencja DNA naturalnie występującego w komórce. Jak stosowano tutaj, określenie "wektor" odnosi się do konstruktu kwasu nukleinowego projektowanego do przeniesienia materiału genetycznego pomiędzy różnymi komórkami gospodarza. Termin "wektor ekspresyjny" odnosi się do wektora, który ma zdolności do wbudowywania i prowadzenia ekspresji heterologicznych fragmentów DNA w kolejnej komórce. Wiele prokariotyczynch i eukariotycznych wektorów ekspresyjnych jest komercyjnie dostępnych. Wybór odpowiednich wektorów ekspresyjnych należy do biegłego w tej dziedzinie. Jak stosowano tutaj, "kaseta ekspresyjna" lub wektor ekspresyjny" oznacza konstrukt kwasu nukleinowego wytworzony technikami rekombinacji lub syntetycznie, z kolejnymi szczególnymi elementami kwasu nukleinowego, które umożliwiają transkrypcję danego kwasu nukleinowego w docelowej komórce lub in vitro. Zrekombinowana kaseta ekspresyjna może być włączona do plazmidu, chromosomu, mitochondrialnego DNA, plastydowego DNA, wirusa, lub fragmentu kwasu nukleinowego. Typowo, część zrekombinowanej kasety ekspresyjnej wektora ekspresyjnego obejmuje, między innymi sekwencje, sekwencję kwasu nukleinowego która ma ulegać transkrypcji i promotor. Jak stosowano tutaj, określenie "plazmid" odnosi się do kołowego dwuniciowego konstruktu DNA stosowanego jako wektor klonujący i który tworzy pozachromosomowy, samoreplikujący się element genetyczny w wielu bakteriach i pewnych komórkach eukariotycznych. Jak stosowano tutaj, określenie "marker (znacznik) do selekcji kodującej sekwencji kwasu nukleinowego" odnosi się do sekwencji nukleotydowej, która jest zdolna do ekspresji komórkach gospodarza i gdzie ekspresja markera do selekcji nadaje komórkom zawierającym gen, który ulega ekspresji zdolność do wzrostu w obecności odpowiedniego selektywnego środka. Jak stosowano tutaj, określenia "promotor" oraz "inicjator transkrypcji" odnoszą się do sekwencji kwasu nukleinowego, która wpływa poprzez zapoczątkowanie transkrypcji na ekspresję genów położonych funkcjonalnie za nim. Promotor ogólnie będzie odpowiednio dobrany do komórki gospodarza, w których docelowy gen ulega ekspresji. Promotor, razem z innymi transkrypcyjnymi i translacyjnymi sekwencjami regulatorowymi kwasu nukleinowego (również nazwanymi "sekwencjami kontrolnymi"), są konieczne aby uzyskać ekspresję danego genu. Ogólnie, transkrypcyjne i translacyjne sekwencje regulatorowe obejmują, nie ograniczając zakresu, sekwencje promotora, rybosomowe miejsca wiążące, sekwencje rozpoczęcia i zakończenia transkrypcji, sekwencje rozpoczęcia i zakończenia translacji, i sekwencje enhansera lub aktywatora. "Gen chimeryczny" lub "heterologiczny konstrukt kwasu nukleinowego", jak zdefiniowano tutaj odnosi się do nie występującego naturalnie genu (to jest, genu, który został wprowadzony do gospodarza), który może być złożony z części różnych genów, obejmujących elementy regulatorowe. Konstrukt genu chimerycznego do transformacji komórki gospodarza jest typowo złożony z regionu regulatorowego transkrypcji (promotor) funkcjonalnie związanego z heterologiczną sekwencją kodującą białko, lub w genie chimerycznym z markerem do selekcji, z gen kodującym białko markera do selekcji, nadające transformowanym komórkom gospodarza oporność na antybiotyki. Typowy gen chimeryczny, do transformacji komórki gospodarza, obejmuje region regulatorowy transkrypcji, który stale ulega ekspresji lub polega indukcji, sekwencję kodującą białko i sekwencję terminatora. Konstrukt genu chimerycznego może również obejmować drugą sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy jeśli wydzielanie docelowego białka jest pożądane. Kwas nukleinowy jest "funkcjonalnie związany", gdy jest umieszczony w połączeniu funkcjonalnym z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA kodujący wydzielniczą sekwencję liderową jest funkcjonalnie związany z DNA kodującym polipeptyd, jeśli ulega on ekspresji jako wstępny

10 10 PL B1 produkt białkowy, który uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub środek zwiększający aktywność jest funkcjonalnie związany z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiążące rybosom jest funkcjonalnie związane z sekwencją kodującą, jeśli jest umieszczone tak aby ułatwiać translację. Ogólnie "funkcjonalnie związany" oznacza, że sekwencje DNA będące połączone sąsiadują ze sobą, a w przypadku wydzielniczej sekwencji liderowej, przylegające i w fazie odczytu. Jednakże, środki zwiększające aktywność nie muszą do siebie przylegać. Połączenie uzyskuje się w wyniku Ligacji i dogodnych miejsc restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, syntetyczne oligonukleotydowe adaptory lub łączniki są stosowane zgodnie z tradycyjną praktyką. Jak stosowano tutaj, określenie "gen" oznacza segment DNA biorący udział w produkcji polipeptydowego łańcucha, który może lub nie obejmować regiony przed i po regionie kodującym, np. 5' nie ulegające translacji (5'UTR) lub "Iiderowe" sekwencje i 3'UTR lub "dodane" sekwencje, jak i sekwencje przerywnikowe (introny) pomiędzy poszczególnymi segmentami kodującymi (egzony). Jak stosowano tutaj, "zrekombinowany/a" obejmuje odniesienia do komórki lub wektora, które zostały zmodyfikowane przez wprowadzenie heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego lub że komórka pochodzi z tak zmodyfikowanej komórki. Zatem, na przykład, zrekombinowane komórki prowadzą ekspresję genów, które nie występują w naturze w identycznej postaci w obrębie natywnej (niezrekombinowanej) postaci komórki lub prowadzą ekspresję natywnych genów, które w innym przypadku ulegają nietypowej ekspresji, obniżonej ekspresji lub nie ulegają ekspresji jako wynik celowego działania ludzi. Termin "wprowadzona", w kontekście wprowadzenia sekwencji kwasu nukleinowego do komórki, oznacza "transfekcję", "transformację" lub "transdukcję" i obejmuje odniesienie do włączenia sekwencji kwasu nukleinowego do eukariotycznej lub prokariotycznej komórki, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego może być włączona do genomu komórki (na przykład, chromosomowy, plazmidowy, plastydowy, lub mitochondrialny DNA), przekształcane do autonomicznej replikacji, lub czasowo ulega ekspresji (na przykład, transfekowany mrna). Jak stosowano tutaj, określenie "ekspresja, ulegać ekspresji" odnosi się do procesu w wyniku którego w oparciu o sekwencję kwasu nukleinowego genu, wytwarzany jest polipeptyd. Proces obejmuje zarówno transkrypcję jak i translację. Określenie "sekwencja sygnałowa" odnosi się do sekwencji aminokwasowej w części końca N białka, która ułatwia wydzielanie dojrzałej formy białka poza komórkę. Dojrzała forma zewnątrzkomórkowego białka pozbawiona jest sekwencji sygnałowej, która jest odcinana w czasie procesu wydzielania. Przez określenie "komórka gospodarza" rozumie się komórkę, która zawiera wektor i umożliwia replikację, lub transkrypcję i translację (ekspresję) konstruktu ekspresyjnego. Komórki gospodarza stosowane według niniejszego wynalazku mogą być prokariotycznymi komórkami, takimi jak E. coli, lub eukaryotycznymi komórkami takimi jak komórki drożdży, komórki roślinne, owadzie, komórki płazów lub ssaków. Jak stosowano tutaj, "skuteczna ilość" lub "farmaceutycznie skuteczna ilość środka aktywnego odnosi się do ilości dostatecznej, aby uzyskać mierzalną zmianę parametru fizjologicznego docelowej komórki lub osobnika i/lub aby dostarczyć lub modulować ekspresję środka aktywnego lub aktywność przez podanie jednej lub więcej niż jednej farmaceutycznych jednostek i dawkowania. Taka skuteczna ilość może być różna w zależności od osoby, w zależności od jej stanu, wzrostu, masy ciała, wieku i/lub zdrowia, trybu podawania środka aktywnego (np. ureazy Iub modulatora ureazy), danego podawanego środka aktywnego i innych czynników. W wyniku tego może być użyteczne określenie empirycznej skutecznej ilości dla danego pacjenta w odniesieniu do zgromadzonego zbioru warunków. Wszystkie publikacje i patenty tutaj cytowane są włączone jako odnośnik celem lepszego opisu i ujawnienia kompozycji i metodyki, które mogą być stosowane w odniesieniu do wynalazku. II. Kompozycja według wynalazku Wynalazek obejmuje, w jednym aspekcie, kompozycję zawierającą ureazę jako środek aktywny stosowany do hamowania wzrostu komórek rakowych. Z ureazą sprzężone jest ugrupowanie naprowadzające jak opisano poniżej, do zwiększenia dostarczania środka aktywnego do komórek raka. Stwierdzono, że narażenie komórek rakowych u pacjenta na działanie ureazy, jak opisano tutaj, stanowi skuteczny sposób leczenia raka u pacjenta. Komórki rakowe mogą być częścią guza, np. guza litego lub półstałego. W innym rozwiązaniu, komórki rakowe mogą krążyć w krwioobiegu osobnika. Rodzaje raka, guzy i/lub nowotwory obejmują nowotworowy wzrost komórek lub tkanki, w którym namnażanie komórek jest niekontrolowane i progresywne. Niektóre takie przerosty są łagodne,

11 PL B1 11 lecz inne są nazwane "złośliwymi" prowadząc do śmierci organizmu. Złośliwe nowotwory są rozpoznawalne od rozrostu łagodnego poprzez to, że oprócz wykazywania agresywnej proliferacji komórek, złośliwe rodzaje raka naruszają otoczenie tkanek i dają przerzuty. Ponadto, złośliwe nowotwory są charakteryzowane poprzez to, że wykazują większe obniżenie różnicowania i ich organizacji względem siebie i otaczających ich tkanek. Poniżej rozważane są związki będące przedmiotem kompozycji według wynalazku. A. Ureaza Jak wspomniano powyżej, środkiem aktywnym w kompozycji jest ureaza. Ureaza może być dowolnego pochodzenia, włącznie np. z bakterii, roślin, grzybów i wirusów. Wiele badań dostarczyło szczegółowe informacje dotyczące genetyki ureaz z wielu różnych, pod względem ewolucyjnym, odmiennych bakterii, roślin, grzybów i wirusów (Mobley, H. L. T. i wsp. (1995) Microbiol. Rev. 59: ; Eur. J. Biochem., 175, (1988); Labigne, A. (1990) Międzynarodowe zgłoszenie opublikowane za nr WO90/04030; Clayon, C. L. i wsp. (1990) Nucleic Acid Res. 18,362; i Patenty U. S. o nr 6,248, 330 i 5,298,399, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik). Szczególnie należy zwrócić uwagę na ureazę, którą odkryto w roślinach (Sirko, A. i Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47 (4): ). Jedną z przykładowych ureaz roślinnych jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej, którą opisano w przykładach 2-3. Przykładową sekwencję aminokwasową ureazy z kanawalii mieczokształtnej przedstawiono jako SEQ ID NO: 7. Użyteczne sekwencje ureazy mogą być znalezione w ogólnodostępnych bazach danych, np. Entrez ( Dodatkowo, mogą być zastosowane startery, które są użyteczne do amplifikacji ureaz z wielu różnych organizmów, jak opisano w pracy Bakera, Κ. M. i Colliera, J. L. ( /webpage/abstracts.html) lub stosując program do projektowania starterów CODEHOP (COnsensusdEgenrate Hybrid Oligonukleotyd Primer) jak opisano w Rose i wsp. (1998) Nucl. Acid Res. 26: Ureaza może kontaktować się z komórkami guza, być zlokalizowana w środowisku zewnątrzkomórkowym lub w płynie tkankowym otaczającym komórki guza, lub ulegać ekspresji w komórkach rakowych lub w komórkach w pobliżu komórek rakowych. Niechcąc wiązać się z żadnymi mechanizmami molekularnymi leżącymi u podstawy pomyślnego hamowania wzrostu komórek rakowych przez ureazę, związek, ureaza może podnosić ph płynu tkankowego, w którym komórki rakowe są zanurzone, przez dodanie ureazy do płynu tkankowego u pacjenta. Ureaza może przekształcać substrat, jakim jest mocznik w amoniak i karbaminian. Ta aktywność enzymatyczna może zwiększać ph powodując, że środowisko będzie bardziej zasadowe (Fig. 1A-1D). Środowisko otaczające komórki raka jest typowo kwasowe (Webb, S. D., i wsp. (2001) Novartis Found Symp 240: ). Zatem, przez podnoszenie w ten sposób ph zewnątrzkomórkowego środowiska, zahamowany zostaje wzrost komórek raka. Zgodnie z powyższym, w pewnych wariantach wynalazku dodanie środka aktywnego powoduje, że ph płynu tkankowego będzie podniesione o około 0,1 jednostkę ph, np. 0,1-0,5 jednostki ph lub więcej. Zatem, zgodnie z wynalazkiem środki aktywne obejmują naturalnie występujące postacie ureazy jak i funkcjonalnie aktywne jej odmiany. Dwa zasadnicze typy odmian sekwencji aminokwasowych są rozważane. Odmiany sekwencji aminokwasowej obejmują te mające jeden lub więcej podstawników w szczególnych aminokwasach, które nie niszczą aktywności ureazy. Odmiany te obejmują odmiany nieme i konserwatywnie zmodyfikowane odmiany które są zasadniczo homologicznie i funkcjonalnie równoważne z naturalnie występującym białkiem. Odmiana naturalnie występującego białka jest "zasadniczo homologiczna" z naturalnie występującym białkiem gdy wykazuje przynajmniej około 80%, korzystniej przynajmniej około 90%, jeszcze korzystniej przynajmniej około 95%, jeszcze bardziej korzystnie 98%, i najkorzystniej przynajmniej około 99% identyczności jej sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową naturalnie występującego białka. Odmiana może różnić się tylko 1 lub aż do 10 lub więcej aminokwasami. Drugi rodzaj odmian obejmuje odmiany wielkościowe ureazy które są wyodrębnione - fragmenty aktywne ureazy. Odmiany wielkościowe mogą być utworzone np. przez fragmentowanie ureazy, przez chemiczne modyfikacje, w wyniku proteolitycznego cięcia enzymami, lub w wyniku połączenia tych metod. Dodatkowo do wytwarzania odmian wielkościowych mogą być zastosowane techniki inżynierii genetycznej, jak i metody syntezy polipeptydów bezpośrednio z reszt aminokwasowych. Terminem "równoważnik funkcjonalny" określa się, że sekwencja odmiany definiuje łańcuch, który produkuje białko mające zasadniczo taką samą biologiczną aktywność jak ureaza występująca naturalnie. Takie równoważne funkcjonalnie odmiany, które obejmują zasadnicze odmiany sekwencji są również objęte zakresem wynalazku. Zatem, równoważne funkcjonalnie odmiany białka ureazy występującego naturalnie będą wykazały dostateczną biologiczną aktywność aby były terapeutycznie

12 12 PL B1 użyteczne. Metody do oznaczania równoważności funkcjonalnej są dostępne w stanie techniki. Biologiczna aktywność może być mierzona stosując testy specyficznie zaprojektowane do pomiaru aktywności białka ureazy występującego naturalnie, jak w przykładzie 3. Dodatkowo, przeciwciała wytworzone przeciwko biologicznie aktywnemu, naturalnie występującemu białku mogą być badane pod kątem ich zdolności do wiązania z równoważną funkcjonalnie odmianą, gdzie skuteczne wiązanie wskazuje na białko mające podobną konformację jak naturalnie występujące białko. Znawca zdaje sobie sprawę, że ze względu na degenerację kodu genetycznego, wiele różnych sekwencji kwasu nukleotydowego kodujących polipeptydy ureazy według wynalazku może być uzyskanych, z których niektóre mogą nieść minimalną homologię sekwencji ze znanymi sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi ureazę. Takie "odmiany nieme" są jednym z typów "konserwatywnie zmodyfikowanych odmian", jak przedyskutowano poniżej. Zgodnie z wynalazkiem dostarczone są wszystkie i dowolne możliwe odmiany sekwencji kwasu nukleinowego kodujące polipeptyd, który może być wytworzony w wyniku wybrania odpowiednich kombinacji opartych na wyborze odpowiednich możliwych kodonów. Kombinacje te są wykonywane zgodnie ze standardowym trójkowym kodem genetycznym, jaki występuje w sekwencjach kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd białka ureazy zgodnie z wynalazkiem. Polipeptydy ureazy według niniejszego wynalazku obejmują jeden lub więcej konserwatywnie zmodyfikowane odmiany (lub po prostu "odmiany konserwatywne") sekwencji znanych polipeptydów ureaz. Takie konserwatywne odmiany obejmują podstawienia, addycje lub delecje, które zmieniają, dodają lub usuwają jeden aminokwas lub niewielki procent aminokwasów. Osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie z pewnością rozpozna, że poszczególne: podstawienie, delecja, lub addycja które powodują podstawienia, delecje lub dodanie jednego aminokwasu lub niewielkiego procentu aminokwasów (typowo poniżej 5%, bardziej typowo poniżej 4%, 2%, 1%, lub mniej) w sekwencji typowo tworzy odmiany konserwatywne, w których w wyniku takich zmian uzyskuje się usunięcie aminokwasu, dodanie aminokwasu, lub podstawienie aminokwasu przez chemicznie podobny aminokwas. Tabele podstawień konserwatywnych zapewniających funkcjonalnie podobne aminokwasy są dobrze znane specjalistom o typowej wiedzy w tej dziedzinie. Tabela 1 przedstawia sześć grup, które zawierają aminokwasy, które obejmują podstawienia konserwatywne lub odmiany konserwatywne względem siebie. T a b e l a 1. Grupa podstawień konserwatywnych 1 Alanina (A) Seryna (S) Treonina (T) 2 Kwas asparaginowy (D) Kwas glutaminowy (E) 3 Asparagina (N) Glutamina (Q) 4 Arginina (R) Lizyna (K) 5 Izoleucyna (I) Leucyna (L) Metionina (M) Walina (V) 6 Fenyloalanina (F) Tyrozyna (Y) Tryptofan (W) Mogą być również utworzone kolejne grupy aminokwasów. Na przykład, aminokwasy mogą być podzielone na grupy, które mają podobną funkcję lub chemiczną strukturę lub skład (np. kwasowe, zasadowe, alifatyczne, aromatyczne, zawierające siarkę). Na przykład, grupowanie ze względu na alifatyczność może obejmować: glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę. Inne grupy zawierające aminokwasy, które stanowią podstawienia konserwatywne względem siebie obejmują poniższe: (i) aromatyczne: fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan (ii) zawierające siarkę: metionina, cysteina; (iii) zasadowe: arginina, lizyna, histydyna i (iv) kwasowe: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina. Patrz Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company, pod kątem dalszego grupowania aminokwasów. Sekwencje białka ureazy według wynalazku, włącznie z konserwatywnie podstawionymi sekwencjami, mogą być obecne jako część większych polipeptydowych sekwencji takich jak te, które występują w wyniku dodania jednej lub więcej niż jednej domen koniecznych do oczyszczania białka

13 PL B1 13 (np. segmenty poli his, segmenty etykiet FLAG, itp.), np. gdzie dodatkowe funkcyjne domeny mają miały lub nie mają żadnego wpływu na aktywność części obejmującej białko ureazy, lub gdzie dodatkowe domeny mogą być usunięte przez etapy obróbki po syntezie, takie jak działanie proteazą. Dodanie jednego lub więcej niż jednego kwasu nukleinowego lub sekwencji, które nie zmieniają kodowanej aktywności cząsteczki kwasu nukleinowego, takie jak dodatkowe niefunkcjonalne sekwencje, prowadzi do odmiany konserwatywnej podstawowej cząsteczki kwasu nukleinowego, a dodanie jednej lub więcej niż jednej reszty aminokwasowej, która nie zmienia aktywności polipeptydu według wynalazku jest odmianą konserwatywną podstawowego polipeptydu. Oba takie typy dodania są rozwiązaniami według wynalazku. Osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie doceni, że wiele odmian konserwatywnych konstruktów kwasu nukleinowego, który ujawniono daje funkcjonalnie identyczny konstrukt. Może być stosowanych wiele różnych metod oznaczania powiązań pomiędzy sekwencjami, obejmujących przypisanie ręczne oraz przypisanie i analizę sekwencji przy pomocy oprogramowania komputerowego. To ostatnie podejście jest korzystne według niniejszego wynalazku, ze względu na zwiększoną wydajność uzyskaną przy metodach z zastosowaniem oprogramowania komputerowego. Dostępnych jest wiele różnych programów komputerowych do przeprowadzenia przypisania sekwencji, lub mogą one być opracowane przez specjalistę w dziedzinie. Jak zauważono powyżej, sekwencje kwasów nukleinowych i polipeptydów (i ich fragmenty) zastosowane w wynalazku nie muszą być identyczne, lecz mogą być zasadniczo identyczne (lub zasadniczo podobne), do odpowiedniej sekwencji polipeptydu ureazy lub cząsteczki kwasu nukleinowego (lub jego fragmentu) lub pokrewnej cząsteczki. Na przykład, polipeptydy mogą być przedmiotem różnych zmian, takich jak insercje, delecje i podstawienia jednego lub więcej aminokwasu lub kwasu nukleinowego, zarówno konserwatywnych jak i nie konserwatywnych, obejmujących przypadki, w których np. takie zmiany mogłyby zapewnić pewne korzyści w ich zastosowaniu np. w zastosowaniu terapeutycznym lub profilaktycznym lub podawaniu lub w zastosowaniu diagnostycznym. Przypisanie i porównanie stosunkowo krótkich sekwencji aminokwasowych (krótszych niż około 30 reszt) jest typowo bezpośrednie. Porównanie dłuższych sekwencji może wymagać bardziej skomplikowanych metod, aby osiągnąć optymalne przypisane dwóch sekwencji. Optymalne przypisanie sekwencji w celu przypisania porównywanych okienek może być przeprowadzone stosując algorytm miejscowych homologii według Smitha i Watermana (1981) Adv Appl Math 2: 482; stosując algorytm przypisania homologii według Needlemana i Wunscha (1970) J Mol Biol 48: 443, przez przeszukiwania pod kątem podobieństwa metodą Pearsona i Lipmana (1988) Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 85: 2444, stosując implementację komputerową tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w oprogramowaniu Wisconsin Gentics Software Package Release 7.0, Gentics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.; i BLAST, patrz np. Altschul i wsp. (1977) Nuc Acids Res 25: i Altschul i wsp. (1990) J Mol Biol 215: ), lub przez badanie pod kątem najlepszego przypisania (to jest, uzyskanie największego procenta podobieństwa sekwencji lub identyczności sekwencji w obszarze porównywanego okienka) wytworzone dowolną metodą wybraną z różnych metod. Przykładowym algorytmem, który jest odpowiedni do oznaczania procentu identyczności sekwencji (procent identyczności) i podobieństwa sekwencji jest algorytm FASTA, który opisano w Pearson, W. R. & Lipman, D. J. (1988) Proc Nat I Acad Sci USA 85: Patrz również, W. R. Pearson (1996) Methods Enzymology 266: Korzystne parametry stosowane w przypisaniu FASTA sekwencji DNA aby obliczyć procent identyczności są zoptymalizowane, BL50 macierz 15:-5, k-krotny=2; utrata punktów w wyniku łączenia (joining penalty) =40, optymalizacja =28; utrata punktów za przerwę =-12, utrata punktów za długość przerwy =-2; i szerokość = 16. Będzie zrozumiałe dla osoby o typowej wiedzy w tej dziedzinie, że powyższa dyskusja dotycząca algorytmów przeszukiwania i porównywania również dotyczy identyfikacji i określania sekwencji polinukleotydowych, z podstawieniem rozpatrywanych sekwencji zawierającym nukleotydowe sekwencje, i gdy jest to odpowiednie wybranie baz danych dla kwasu nukleinowego. B. Związana cząstka chemiczna Kompozycja według wynalazku może obejmować cząstkę chemiczną która jest związana z ureazą, aby zwiększyć dostarczanie ureazy do komórek rakowych. Szeroki wybór związanych chemiczne cząstek jest możliwy do stosowania jak opisano poniżej. B1. Ugrupowania naprowadzające

14 14 PL B1 Ugrupowania naprowadzające są rozważane jako chemiczne cząstki według niniejszego wynalazku i wiążą się ze zdefiniowanym, wybranym typem komórki lub docelową populacją komórek, takich jak komórki rakowe. Ugrupowania naprowadzające użyteczne w tym względzie obejmują przeciwciała i fragmenty przeciwciał, peptydy i hormony. Białka odpowiadające znanym receptorom powierzchniowym komórek (obejmujące Iipoproteiny o małej gęstości, transferynę i insulinę), enzymy fibrinolityczne, anty-her2, białka wiążące płytek takie jak aneksyny i czynniki modyfikujące biologiczną odpowiedź (obejmujące interleukinę, interferon, erytropoetynę i czynnik stymulacji wzrostu kolonii) są również rozważane jako ugrupowania naprowadzające. Oligonukleotydy np. antysensowe oligonukleotydy, które są komplementarne z częścią kwasu nukleinowego docelowej komórki, mogą być stosowane jako ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Ugrupowania naprowadzające mogą również być oligonukleotydami, które wiążą się z powierzchnią docelowej komórki. Analogi powyżej wymienionych ugrupowań naprowadzających, które zachowują zdolność do wiązania się ze zdefiniowaną docelową populacją komórek mogą również być stosowane jako ugrupowania naprowadzające. Funkcjonalne równoważniki wymienionych powyżej ugrupowań naprowadzających są również użyteczne jako ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem wynalazku. Przykładowymi funkcjonalnymi równoważnikami ugrupowań naprowadzających jest organiczny chemiczny konstrukt zaprojektowany, aby naśladować odpowiednie układy (konfiguracje) i/lub orientację w celu wiązania się z komórką docelową dla ugrupowania naprowadzajacego. Inny funkcjonalny równoważnik ugrupowania naprowadzającego stanowi krótki polipeptyd, który wykazuje powinowactwo wiązania takie jak ugrupowanie naprowadzające. Korzystne ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem stanowią przeciwciała, peptydy, oligonukleotydy i tym podobne, które reagują z antygenem na powierzchni docelowej komórki. Mogą być zastosowane przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne, które są bądź dostępne komercyjnie, bądź opisane w literaturze. Przeciwciała mogą być całymi przeciwciałami lub tylko ich fragmentami. Monoklonalne przeciwciała i ich fragmenty mogą być wytwarzane zgodnie z tradycyjnymi technikami, takimi jak synteza w hybrydomie, techniki rekombinacji DNA i synteza białek. Użyteczne monoklonalne przeciwciała i ich fragmenty mogą pochodzić z dowolnego gatunku (obejmującego ludzi) lub mogą być utworzone jako chimeryczne białka, które wykorzystują sekwencje z więcej niż jednego gatunku. W jednym rozwiązaniu wynalazku, jako ugrupowania naprowadzające stosowane są ludzkie monoklonalne przeciwciała lub humanizowane mysie przeciwciała. Humanizowane ugrupowania naprowadzające są zdolne do obniżania immunoreaktywności przeciwciała lub polipeptydu w organiźmie otrzymującego je gospodarza, pozwalając na zwiększenie półokresu życia i zmniejszenie niekorzystnych reakcji immunologicznych. Mysie monoklonalne przeciwciała mogą być humanizowane stosując, np., genetyczną rekombinację sekwencji nukleotydowej kodującej mysi region Fv lub ich regiony determinujące komplementarność z sekwencją nukleotydową kodującą ludzką domenę stałego regionu i region Fc. Mysie reszty mogą również być zachowane w obrębie ludzkiego szkieletu domeny zmiennego regionu, aby zapewnić właściwą charakterystykę wiązania z miejscem docelowym. Nieograniczający przykład ugrupowania naprowadzającego stanowi przeciwciało anty-α-2-gp przeciwko glejowym komórkom mózgu (alfa-2-glikoproteina) które opisali Slepnev i wsp., Bioconjugate Chem. 3: (1992). Przeciwciała uzyskane metodami inżynierii genetycznej w celu dostarczania różnych środków aktywnych do komórek raka przedstawiono w formie przeglądowej w pracy Bodey'a, B. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1 (4): W innym rozwiązaniu wynalazku, ugrupowanie naprowadzające jest ligandem, który reaguje z receptorem na powierzchni docelowej komórki. Zatem, ugrupowanie naprowadzające może obejmować, nie ograniczając zakresu, hormony o powinowactwie do komórkowego składnika wiążącego, dowolnej cząsteczki zawierającej węglowodanową część cząsteczki rozpoznawaną przez komórkowy składnik wiążący i leki lub małe cząsteczki, które wiążą się z komórkowym składnikiem wiążącym. Określenie "składnik wiążący" obejmuje zarówno cząsteczkę receptora i jak cząsteczkę akceptora. Korzystnie, składnik wiążący jest składnikiem wiążącym na powierzchni komórek. W jednym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające jest naturalnie występującym białkiem, takim jak insulina, które wiąże się z docelowym miejscem. Cytokiny, obejmujące interleukiny i czynniki takie jak czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów/makrofagów (GM-CSF) i czynnik martwicy guza (TNF) również stanowią specyficzne ugrupowania naprowadzające, które jak wiadomo wiążą się ze specyficznymi komórkami prowadzącymi ekspresję na wysokim poziomie ich receptorów (Terlikowski, SJ (2002) Toxicology 174 (3): ).

15 PL B1 15 W celu obniżenia narażenia działania ureazy lub innego środka aktywnego na komórki lub tkanki nie będące celem działania, ugrupowania naprowadzające mogą być przeszukiwane tak, aby zidentyfikować te, które wykazują minimalną reaktywność z komórkami/tkankami nie będącymi celem działania, jednocześnie zachowując specyficzność i reaktywność wobec komórek/tkanek docelowych. W wyniku obniżenia działania niespecyficznego (brak wpływu na komórki nie będące celem działania) (i niekorzystnej lokalizacji i/lub toksyczności poza celem działania), mogą być podawane zwiększone dawki ureazy lub innego środka aktywnego. To umożliwia podawanie najwyższych możliwych stężeń ureazy lub innego środka terapeutycznego w celu maksymalnego działania na komórki docelowe, podczas gdy toksyczność względem komórki nie będącej celem działania pozostaje poniżej niedopuszczalnego progu toksyczności. W pewnych rozwiązaniach wynalazku, wykorzystane są koniugat dwóch lub więcej środków aktywnych z ugrupowaniem naprowadzającym, gdzie każdy koniugat obejmuje różne ugrupowania naprowadzające np. różne rodzaje przeciwciał. Każde z zastosowanych ugrupowań naprowadzających wiąże się z różnym miejscem regionu docelowego, które może być związane z takim samym lub różnym miejscem docelowym. Składnik środka aktywnego każdego podawanego koniugatu może być takie same lub różne. Patrz np. patenty U.S. nr 4,867,962 i 5,976,535, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik. W praktyce tego rozwiązania wynalazku, połączenie miejsca docelowego koniugatu środka aktywnego z miejscem docelowym jest poprawione, ponieważ każde ugrupowanie naprowadzające, np. cząsteczki przeciwciała, rozpoznaje inny region miejsca docelowego np. epitop miejsca docelowego. To alternatywne podejście do regionu miejsca docelowego dostarcza więcej punktów wiążących, możliwych w obrębie miejsca docelowego dla środka aktywnego. Wskutek tego, można uniknąć rzeczywistego lub skutecznego wysycenia miejsc docelowych, np. przez wysycenie epitopu i/lub zawadę steryczną. Zatem, addycyjna akumulacja środka aktywnego, np. ureazy, może być uzyskana. W innym rozwiązaniu, lub łącznie, dodatkowe specyficzne względem ureazy produkty genowe mogą być zastosowane jako środki aktywne, np. w celu utworzenia katalitycznie aktywnego holoenzymu w miejscu docelowym. Przykładowy apoenzym ureazy obejmuje podjednostki gamma, beta i alfa kodowane przez bakteryjne geny ureabc (Burne, R. A. i Chen, Y. M. (2000) Microbes and Infection 2: ). Wzory reaktywności krzyżowej monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko poszczególnym miejscom docelowym mogą być analizowane w celu zidentyfikowania zbioru dwóch lub więcej monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla miejsca docelowego z nie nachodzącą na siebie reaktywnością krzyżową stosowaną w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych. Określenie "nie nachodząca na siebie reaktywność krzyżowa" oznacza, że tkanki nie będące celem działania związane przez cząsteczki jednego przeciwciała różnią się zasadniczo od tkanek nie będących celem działania związanych przez inne cząsteczki przeciwciała. Wzory reaktywności krzyżowej różnią się w zakresie koniecznym, aby stosunkowo obniżyć poddanie działaniu środka aktywnego w zastosowaniach terapeutycznych. Korzystne jest mniejsze nakładanie się par przeciwciał (lub większych grup przeciwciał). Przeciwciała mogą być przeszukiwane różnymi metodami. Analizy immunohistochemiczne mogą być zastosowane do określenia reaktywności z tkanką docelową i reaktywności krzyżowej z tkanką nie będącą celem działania. Tkanki, z którymi cząsteczki przeciwciała się wiążą mogą być zidentyfikowane przez narażenie tkanek na działanie przeciwciała; przemycie tkanki w celu usunięcia wszelkiego niezwiązanego przeciwciała i wykrywanie obecności związanego przeciwciała. Procedury histochemiczne in vitro są znane w tej dziedzinie. Patrz np. Sanchez-Islas, E. i Leon-Olea, M. (2001) Nitric Oxide 5 (4): Kompozycja według niniejszego wynalazku może również być wykorzystana w leczeniu guzów wydzielających hcg. Ponieważ trofoblast łożyskowy jest typowym miejscem syntezy hcg, jest zrozumiałe, że zarówno ciążowe jak i nieciążowe guzy trofoblastyczne syntetyzują i wydzielają hcg. Faktycznie, pomiary hcg są użyteczne w diagnostyce tych guzów, klasyfikacji według stadiów zaawansowania guzów i do monitorowania efektu leczenia. Ponadto, pewne nietrofoblastyczne guzy mogą produkować hcg ekotopowo. hcg może działać jako czynnik wzrostu w pewnych typach guzów (Melmed S. i Braunstein GD: Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation of Nb 2 rat lymphoma cell. J. Clin. Endocrinol. Metab 56: , (1983)). Patrz np. Patent U. S. Nr 6,448,022, który jest włączony tutaj jako odnośnik. Dlatego, zgodnie z jednym wariantem wynalazku, zastosowanie przeciwciała anty-hcg, aby naprowadzić środek aktywny przeciwko guzom wydzielającym hcg powstrzymuje wzrost guza wydzielającego hcg. Zatem, w pewnych rozwiązaniach, cząstka chemiczna według wynalazku jest

16 16 PL B1 ugrupowaniem naprowadzającym połączonym ze środkiem aktywnym i stanowi przeciwnowotworowe przeciwciało przeciwko antygenowi, przeciwciało anty-hcg lub Iigand zdolny do wiązania specyficznie z receptorami powierzchniowymi komórek raka. Ugrupowanie naprowadzające jest korzystnie, polipeptydem związanym z enzymem ureazy aby utworzyć białko fuzyjne. Jak zauważono powyżej, zgodnie z jednym wariantem według wynalazku, środek aktywny jest bezpośrednio sprzężony z ugrupowaniem naprowadzającym. W innym zastosowaniu wynalazku, dwulub trzy-etapowe rozwiązanie zastosowano, aby dostarczyć środek aktywny do komórek rakowych. Zatem, środek aktywny może obejmować pierwszą wiążącą substancję biorącą udział w wiązaniu, która jest zdolna do oddziaływania z drugą substancją wiążącą biorącą udział w wiązaniu, a cząstka chemiczna może obejmować ugrupowanie naprowadzające, które obejmuje drugą wiążącą substancję biorącą udział w wiązaniu. Te zastosowania opisano bardziej szczegółowo w części III, poniżej. Znawca doceni, że zgodnie z wynalazkiem ugrupowania naprowadzające i środki aktywne mogą być połączone razem w dowolnym porządku. Zatem, gdy ugrupowanie naprowadzające jest polipeptydem, środek aktywny może być połączony zarówno z końcem aminowym, jak i karboksylowym ugrupowania naprowadzającego. Ugrupowanie naprowadzające może również być połączona z wewnętrznym regionem środka aktywnego, lub odwrotnie, środek aktywny może być połączony z wewnętrznym miejscem ugrupowania naprowadzającego, dopóki przyłączony element nie wpływa niekorzystnie na odpowiednie aktywności cząsteczki. Ugrupowanie naprowadzające i środek aktywny mogą być łączone dowolnym z wielu środków dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Typowo, środek aktywny jest sprzężony, bądź bezpośrednio bądź poprzez linker (łącznik), z ugrupowaniem naprowadzającym. Jednakże, gdy zarówno ugrupowanie naprowadzające jak i środek aktywny są polipeptydami, może być korzystnie, aby prowadzić ekspresję zrekombinowanej chimerycznej cząsteczki jako białka fuzyjnego o jednym łańcuchu. W jednym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające (np. αhegfr IgG Ab) jest chemicznie sprzężone z środkiem aktywnym (ureazą). Środki chemicznie sprzęgające cząsteczki są dobrze znane specjalistom. Procedura łączenia środka aktywnego z przeciwciałem lub inną polipeptydowym ugrupowaniem naprowadzającym będzie różna w zależności od chemicznej struktury środka. Polipeptydy typowo zawierają wiele różnych grup funkcyjnych; np. grupy kwasu karboksylowego (COOH) lub wolnej aminy (NH 2 ), które są dostępne w reakcji z odpowiednią grupą funkcyjną w obrębie środka aktywnego, aby związać z nią ugrupowanie naprowadzające. W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i/lub środek aktywny mogą być przeprowadzone w pochodne, aby uzyskać na powierzchni lub przyłączyć dodatkowe reaktywne grupy funkcyjne. Tworzenie pochodnych może wymagać przyłączenia dowolnego z wielu różnych cząsteczek Iinkerowych takich jak te dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford III. "Linker (łącznik)", jak stosowano tutaj, oznacza cząsteczkę, którą zastosowano, aby połączyć ugrupowanie naprowadzające ze środkiem aktywnym. Linker jest zdolny do tworzenia wiązań kowalencyjnych zarówno z ugrupowaniem naprowadzającym jak i z ureazą. Odpowiednie Iinkery są dobrze znane znawcom i obejmują, nie ograniczając zakresu, węglowe Iinkery o prostych lub rozgałęzionych łańcuchach, heterocykliczne węglowe linkery, lub Iinkery peptydowe. Gdy ugrupowanie naprowadzające i cząsteczka środka aktywnego są polipeptydami, linkery mogą być połączone ze składowymi aminokwasami przez grupy boczne (np. przez wiązanie dwusiarczkowe z cysteiną). Jednakże, w korzystnym rozwiązaniu, linkery będą połączone z węglem alfa grup aminowej i karboksylowej końcowych aminokwasów. W celu utworzenia żądanego immunokoniugatu może być stosowany dwufunkcyjny linker mający jedną grupę funkcyjną reaktywną z grupą znajdującą się na danym środku, a drugą grupę oddziałującą z przeciwciałem. W innym rozwiązaniu, tworzenie pochodnych może wymagać chemicznego działania na ugrupowania naprowadzające, np. cięcie glikolu cukrowej części cząsteczki glikoproteinowego przeciwciała nadjodanem, aby utworzyć wolne grupy aldehydowe. Wolne grupy aldehydowe w obrębie przeciwciała mogą być poddane reakcji z wolnymi grupami aminowymi lub hydrazynowymi na środku aktywnym, aby związać się ze środkiem, (patrz Patent US nr 4,671,958). Znane są również procedury wytwarzania wolnych grup suifhydrylowych w obrębie polipeptydu, takiego jak przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, (patrz Patent US nr 4,659,839). Znanych jest wiele procedur i cząsteczek Iinkera do połączenia z białkami, takimi jak przeciwciała, różnych związków obejmujących chelaty metalu radionuklidów, toksyny i leki (patrz np. europejskie zgłoszenie patentowe nr 188,256; patenty US nr 4,671,958,4, 659,839, 4,414,148,4, 699,784;

17 PL B1 17 4,680,338; 4,569,789; i 4,589,071 oraz praca Borlinghausa i wsp. (1987) Cancer Res. 47: ). Zwłaszcza, wytwarzanie różnych immunotoksyn jest dobrze znane w tej dziedzinie i może być znalezione, na przykład w "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe i wsp., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, str (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657, patenty US nr 4,545,985 i 4,894,443. W pewnych warunkach pożądane jest aby uwolnić cząsteczkę środka aktywnego z ugrupowania naprowadzającego, po osiągnięciu przez chimeryczną cząsteczkę swojego miejsca docelowego. Dlatego, chimeryczne koniugaty zawierające linkery, które mogą być odcinane w pobliżu miejsca docelowego mogą być stosowane, gdy efektor ma być uwolniony w miejscu docelowym. Odcinanie linkera, aby uwolnić środek aktywny od ugrupowania naprowadzającego, może być przeprowadzone w wyniku działania enzymatycznego lub w warunkach, którym koniugat jest poddany bądź wewnątrz docelowej komórki lub w pobliżu miejsca docelowego. Powinno być docenione, że gdy miejscem docelowym jest guz, może być stosowany linker, który może być odcięty w warunkach obecnych w miejscu guza (np. gdy jest narażony na działanie enzymów związanych z guzem lub kwasowemu ph). Wiele różnych odcinanych linkerów jest znanych znawcom (patrz Patenty US nr 4,618,492; 4,542,225, i 4,625,014). Mechanizmy uwalniania środka aktywnego od tych grup Iinkerowych obejmują na przykład, naświetlanie nietrwałego w wyniku napromieniowania wiązania i hydrolizę katalizowaną kwasem. Patent US nr 4,671,958, na przykład, przedstawia opis immunokoniugatów zawierających linkery, które są odcinane w miejscu docelowym in vivo przez proteolityczne enzymy układu komplementarnego obecnego w organizmie pacjenta. Rozpatrując wiele różnych metod, które opisywano w odniesieniu do połączenia różnych radiodiagnostycznych związków, radioterapeutycznych związków, leków, toksyn i innych środków z ugrupowaniami naprowadzającymi, osoba biegła w tej dziedzinie będzie w stanie określić odpowiedni sposób przyłączenia danego środka do wybranego ugrupowania naprowadzającego. Gdy ugrupowanie naprowadzające i/lub środek aktywny jest stosunkowo krótki, mogą one być zsyntetyzowane stosując standardowe chemiczne techniki syntezy peptydów. Gdy obie cząsteczki są stosunkowo krótkie, chimeryczna cząsteczka może być zsyntetyzowana jako pojedyńczy ciągły polipeptyd. W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i środek aktywny mogą być zsyntetyzowane oddzielnie, a następnie połączone przez kondensację aminowego końca jednej cząsteczki z karboksylowym końcem drugiej cząsteczki, w wyniku czego tworzy się wiązanie peptydowe. W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i cząsteczka środka aktywnego mogą zostać skondensowane z jednym końcem peptydowej cząsteczki łącznika, przez co tworzy się ciągłe białko fuzyjne. Synteza w stałej fazie, w której C-końcowy aminokwas sekwencji jest przyłączony do nierozpuszczalnego podłoża, a następnie kolejno następuje dodanie pozostałych aminokwasów w sekwencji jest uważane za jedno z możliwych rozwiązań sposobu chemicznej syntezy polipeptydów według wynalazku. Techniki syntezy w stałej fazie opisano w pracy Barany'a i Merrifielda, Solid Phase Peptide Synthesis; str w Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Tom 2: Special Metods in Peptide Synthesis, część A., Merrifielda, i wsp.. J. Am. Chem. Soc., 85: (1963) i Stewarta i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. wyd. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). W korzystnym rozwiązaniu, chimeryczne białka fuzyjne według niniejszego wynalazku są zsyntetyzowane stosując technikę rekombinacji DNA. Ogólnie, obejmuje to stworzenie sekwencji DNA, która koduje białko fuzyjne, umieszczenie tego DNA w kasecie ekspresyjnej pod kontrolą odpowiedniego promotora, prowadzenie ekspresji białka w gospodarzu, wyodrębnienie uzyskanego w wyniku ekspresji białka i jeśli jest to wymagane, odzyskania naturalnej struktury białka. DNA kodujący białka fuzyjne według wynalazku może być wytworzony w dowolny, odpowiedni sposób, obejmujący na przykład, klonowanie i cięcie odpowiednich sekwencji lub bezpośrednią chemiczną syntezę sposobami takimi jak metoda fosfotriestrowa według Naranga i wsp. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; metoda fosfodiestrowa według Browna i wsp. (1979) Meth. Enzymol. 68: ; metoda dietylofosforamidynowa według Beaucage'a i wsp. (1981) Tetra. Lett., 22: ; i metodą z zastosowaniem stałego podłoża według patentu US nr 4,458,066. W wyniku chemicznej syntezy wytwarza się jednoniciowy oligonukleotyd. Może on być przekształcany w dwuniciowy DNA metodą hybrydyzacji z sekwencją komplementarną, lub przez polimeryzację z polimerazą DNA stosując jedną nić jako matrycę. Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że podczas gdy chemiczna synteza DNA jest ograniczona do sekwencji o długości około 100 zasad, dłuższe sekwencje mogą być otrzymywane w wyniku Iigacji krótszych sekwencji.

18 18 PL B1 W innym rozwiązaniu, podsekwencje mogą być klonowane i odpowiednie podsekwencje mogą być cięte stosując odpowiednie enzymy restrykcyjne. Fragmenty te mogą następnie być Iigowane aby uzyskać żądaną sekwencję DNA. Podczas gdy dwie cząsteczki są korzystnie zasadniczo bezpośrednio połączone razem, osoba biegła w dziedzinie doceni, że cząsteczki mogą być rozdzielone łącznikiem peptydowym składającym się z jednego lub więcej niż jednego aminokwasu. Ogólnie łącznik nie będzie miał żadnej specyficznej biologicznej aktywności innej niż połączenie białek lub zachowanie pewnej minimalnej odległości lub innego przestrzennego oddziaływania pomiędzy nimi. Jednakże, składowe aminokwasy łącznika mogą być tak dobrane, aby wpływały na pewne właściwości cząsteczki, takie jak składanie, wypadkowy ładunek, lub hydrofobowość. Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białka fuzyjne mogą ulegać ekspresji w wielu różnych typach komórek gospodarza, obejmujących E. coli, innych bakteryjnych gospodarzy, drożdże, i różne komórki wyższych eukariontów, takie jak linie komórkowe COS, CHO i HeLa oraz linie komórkowe szpiczaka. Zrekombinowany gen kodujący białko będzie funkcjonalnie związany z odpowiednią sekwencją kontrolującą ekspresję dla każdego każdego gospodarza. W przypadku E. coli konstrukt obejmuje promotor taki jak promotory T7, trp, lub lambda, miejsce wiązania rybosomu i korzystnie sygnał zakończenia transkrypcji. W przypadku komórek eukariotycznych, sekwencje kontrolne będą obejmować promotor i korzystnie środek zwiększający aktywność pochodzący z genów kodujących immunoglobuliny, SV40, cytomegalowirus, itp. i sekwencję poliadenylacji, i mogą być obecne sekwencje donora i akceptora zespalania. Plazmidy według wynalazku mogą być przenoszone do wybranej komórki gospodarza dobrze znanymi metodami takimi jak transformacja E. coli, z zastosowaniem chlorku wapnia i traktowanie fosforanem wapnia lub elektroporacja komórek ssaczych. Komórki transformowane plazmidami mogą być wybrane przez zastosowanie genów nadających oporność na antybiotyki niesionych na plazmidach, takich jak geny amp, gpt, neo i hyg. Po uzyskaniu ekspresji, zrekombinowane białka fuzyjne mogą być oczyszczane zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w stanie techniki, obejmującymi wytrącenie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu i tym podobne (patrz - R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Tom 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y.). W celach farmaceutycznych korzystne są zasadniczo czyste kompozycje mające przynajmniej około 90 do 95% homogenności, a najbardziej korzystne są kompozycje o 98 do 99% homogenności. Po zakończeniu oczyszczania, częściowo lub do homogenności w zależności co jest pożądane, polipeptydy mogą być stosowane terapeutycznie. Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że w wyniku syntezy chemicznej, ekspresji biologicznej, lub oczyszczania, naprowadzające białko fuzyjne może mieć konformację zasadniczo różną niż występujące w naturze konformacje części składowych polipeptydów. W tym przypadku, może być konieczna denaturacja i redukcja polipeptydu, a następnie umożliwienie ponownego składania polipeptydu do korzystnej konformacji. Metody redukcji i denaturacji białka, i indukowanie ponownego składania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (patrz Dębiński i wsp. (1993) J. Biol. Chem., 268: ; Kreitman i Pastan (1993) Bioconjug. Chem. 4: ; i Buchner, i wsp. (1992) Anal. Biochem. 205: ). Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że modyfikacje mogą być dokonane w naprowadząjącym białku fuzyjnym bez obniżania ich biologicznej aktywności. Pewne modyfikacje mogą być wykonane w celu ułatwiania klonowania, ekspresji, lub wbudowania ugrupowania naprowadzającego do białka fuzyjnego. Takie modyfikacje są dobrze znane znawcom i obejmują, na przykład, metioninę dodaną na końcu aminowym, aby zapewnić miejsce inicjacji, lub dodatkowe aminokwasy umieszczone na każdym końcu aby utworzyć dogodnie zlokalizowane miejsca restrykcyjne lub kodony terminacji. B 2. Zamknięte (schwytane) środki aktywne W pewnych rozwiązaniach, wynalazek może być zastosowany w postaci pęcherzyków takich jak liposomy i/lub nanokapsułki jako chemiczne cząstki do dostarczania środka aktywnego lub środków aktywnych, np. ureazy do komórek raka. Takie preparaty mogą być korzystne do wprowadzania farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów polipeptydów, środków farmaceutycznych i/lub przeciwciał ujawnionych tutaj. Tworzenie i zastosowania liposomów jest ogólnie znane specjalistom w tej dziedzinie. (Patrz np. Backer, M. V., i wsp. (2002) Bioconjug Chem 13 (3): 462-7). W korzystnym rozwiązaniu, ujawniona kompozycja może być zamknięta w liposomie.

19 PL B1 19 Nanokapsułki mogą ogólnie zamykać związki w stabilny i powtarzalny sposób (Whelan, (2001) Drug Discov. Today 6 (23): ). Aby unikać działań ubocznych ze względu na wewnątrzkomórkowe polimerowe przeciążanie, takie ultradrobne cząsteczki (o takiej wielkości około 0,1 μm ) mogą być zaprojektowane stosując polimery zdolne do ulegania degradacji in vivo. Ulegające biodegradacji poliizobutylocyjanoacrylanowe nanocząsteczki, które spełniają te wymagania są rozważane do stosowania w niniejszym wynalazku, i takie cząsteczki mogą być z łatwością wykonane, jak opisano np. w Lambert G., i wsp. (2001) Int J Pharm 214 (1-2): Metody wytwarzania polialkilocyjanoakrylanowych nanocząsteczek zawierających biologicznie aktywnych substancji i ich zastosowanie są opisane w patentach US nr 4,329,332,4, 489,055 i 4,913,908. Nanokapsułki są dostępne komercyjnie ze źródeł takich jak Capsulution, Inc. ( Farmaceutyczne kompozycje zawierające nanokapsułki do dostarczania środków aktywnych opisano w patentach U.S. nr 5,500,224,5, 620,708 i 6,514,481. W patencie US nr 5,500,224 opisano kompozycję farmaceutyczną w postaci koloidalnej zawiesiny nanokapsułek zawierających fazę olejową złożoną zasadniczo z oleju zawierającego rozpuszczony w nim środek powierzchniowoczynny i zawieszone w nim wiele różnych nanokapsułek mających średnicę poniżej 500 nanometrów. W US nr 5,620,708 opisano kompozycje i metody podawania leków i innych środków aktywnych. Kompozycje obejmują cząsteczki nośnika środka aktywnego połączone z wiążącą częścią cząsteczki, która wiąże się specyficznie z ugrupowaniem naprowadzającym obecnym na powierzchni ssaczego enterocytu. Wiążąca część cząsteczki wiąże się z ugrupowaniem naprowadzającym z powinowactwem wiązania lub zachłannością dostateczną, aby zapoczątkować endocytozę lub fagocytozę danego nośnika środka aktywnego tak aby nośnik został zaabsorbowany przez enterocyt. Środek aktywny zostanie następnie uwalniany z nośnika do krążenia dużego organizmu gospodarza. W ten sposób, można uniknąć degradacji leków łatwo degradujących, takich jak polipeptydy, w jelitach podczas, gdy absorpcja białek i polipeptydów z przewodu pokarmowego jest zwiększona. W innym rozwiązaniu, wynalazek rozważa uwalnianie środka aktywnego w środowisku otaczającym docelowe komórki. Na przykład, w jednym rozwiązaniu, ureaza jest uwalniana z nanokapsułek po związaniu ugrupowania naprowadzającego z docelowymi komórkami, tak że ureaza jest uwalniana do mikrośrodowiska otaczającego komórki docelowe, np. komórki guza. W patentach US nr 6,379,683 i 6,303,150 opisano metody wytwarzania nanokapsułek i ich zastosowania, i dokumenty te są włączone tutaj jako odnośniki. Kontaktowanie obejmuje dodanie do komórki koniugatu zawierającego ugrupowanie naprowadzające i jeden peptyd tworzący zwój charakteryzujący się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziaływania z drugim, przeciwnie naładowanym peptydem tworzącym zwój, aby utworzyć stabilny heterodimer o α-helisowym solenoidzie. Następnie, Iiposom jest podany do komórki. Liposom obejmuje zewnętrzną powierzchnię i wewnętrzną przestrzeń; środek aktywny np. ureaza, zlokalizowana jest w wewnętrznej przestrzeni Iiposomu i wiele innych peptydów, gdzie każdy inny peptyd jest połączony z zewnętrzną powierzchnią liposomu. W innym rozwiązaniu, opisanym szczegółowo poniżej, kontaktowanie obejmuje podawanie liposomów do komórki, przy czym liposomy zawierają środek aktywny, np. ureazę, w postaci zamkniętej i zewnętrzne powierzchnie liposomu zawierają ugrupowanie naprowadzające na komórkę skutecznie wiążące się specyficznie z docelową powierzchnią i polimer hydrofilowy powlekający skutecznie, aby ochraniać ugrupowanie naprowadzające przed oddziaływaniem z docelową powierzchnią. Polimer hydrofilowy powlekający może być wykonany z polimerowych łańcuchów, które są kowalencyjnie połączone z powierzchniowymi składnikami lipidowymi w Iiposomach wiązaniami, które mogą być zniesione. W tym rozwiązaniu, środek uwalniający jest dodany do komórek guza w ilości skutecznej aby spowodować uwalnianie zasadniczej części wiązań w dodanych liposomach, przez co wystawia się docelową powierzchnię na działanie ugrupowania naprowadzającego. Wiązania, które mogą być zniesione mogą być wiązaniami usuwanymi chemicznie takimi jak wiązania dwusiarczkowe, estrowe i peptydowe. Korzystnie, część cząsteczki mająca powinowactwo skutecznie specyficznie wiąże się z antygenem specyficznym dla raka. Rozważany jest sposób terapii osobnika będącego ssakiem, oparty na liposomach. Sposób obejmuje układowe podawanie osobnikowi, np. podawanie dożylne, liposomów mających związane powierzchniowo ugrupowania naprowadzające i polimerową hydrofilową powłokę. Polimerowa hydrofilowa powłoka, obejmująca uwalniane połączone polimerowe łańcuchy, jest skuteczna aby osłaniać ugrupowanie naprowadzające przed oddziaływaniem z jej miejscem docelowym. Korzystne polimery hydrofilowe są przedyskutowane powyżej. Podawane liposomy mogą krążyć w krążeniu dużym aż osiągną żądane rozmieszczenie biologiczne. Środek uwalniający, jak opisano poniżej, jest podawany

20 20 PL B1 osobnikowi w ilości skutecznej, aby spowodować cięcie zasadniczej części np. powyżej około 50%, korzystnie powyżej około 70%, i korzystniej powyżej około 90% uwalnianych wiązań w podanych liposomach. Ugrupowania naprowadzające zostają odsłonięte w wyniku uwalniania wiązań polimerowych hydrofilowych łańcuchów i mogą oddziaływać z miejscem docelowym. Liposomy są stosowane do leczenia guzów litych. Liposomy obejmują ureazę i ewentualnie, dodatkowy środek aktywny, np. Iek przeciwnowotworowy, w postaci schwytanej i są skierowane do regionu guza w wyniku skutecznego, specyficznego wiązania ugrupowania naprowadzającego z antygenem specyficznym guza. W przykładowej metodzie, liposomy są ukierunkowane na komórki guzów śródbłonka naczyń przez włączenie Iigandu VEGF do liposomów, przez selektywne połączenie z receptorami Flk-1,2 ulegającymi ekspresji na proliferujących komórkach guza śródbłonka (Niederman, T. M., i wsp. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99 (10): ). Korzystnie, liposomy mają wielkości od około 30 do 400 nm. Wykazano, że liposomy w tym zakresie wielkości mogą dostawać się do guzów przez "przerwy" obecne w wyściółce komórek śródbłonka naczyń guza (Maruyama, K. i wsp. (1999) Adv. Drug. Deliv. Rev. 40 (1-2): ). Po podaniu liposomów, np. przez podawanie dożylne i po dostatecznym okresie czasu pozostawionym, aby umożliwić odpowiednie rozmieszczenie liposomów w organizmie osobnika i związanie się z guzem, środek uwalniający jest podawany osobnikowi, aby uwolnić hydrofilową powłokę na powierzchni liposomów. Uwolnienie powłoki na powierzchni liposomów skutecznie odkrywa ugrupowanie naprowadzające i umożliwia wiązanie liposomów z docelowymi komórkami. W jednym rozwiązaniu, hydrofitowa powłoka na powierzchni jest połączona z Iiposomami przez wiązania wrażliwe na ph. Wiązania te są znoszone po tym, gdy liposomy zwiążą się z guzem. Liposomy w dowolnym z rozwiązań opisanych powyżej mogą, ewentualnie, obejmować jeden lub więcej zamkniętych przeciwnowotworowych leków lub środków obrazujących lub obie te substancje. Liposomy mogą być podane i pozostawione do odpowiedniego rozmieszczenia, po czym środek uwalniający może być podawany, aby uwolnić hydrofitową powłokę na powierzchni i odkryć przyłączone ugrupowanie naprowadzające, i zapoczątkować wiązanie. Zatem, zamknięty lek przeciwnowotworowy lub środek obrazujący lub obie te substancje są specyficznie i miejscowo podawane w miejscu docelowym. Przykładowe leki przeciwnowotworowe opisano w części III. A, poniżej. Przykładowe środki obrazujące stosowane w sposobie według wynalazku opisano w części III. B, poniżej. Liposomy mogą być wytworzone i podawane jak opisano w patencie US Nr 6,043,094, który jest włączony tutaj jako odnośnik. W niniejszym wynalazku mogą być zastosowane dodatkowe środki do podawania, takie jak w małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV s), jak opisano w patencie US Nr 6,180,114, który jest włączony tutaj jako odnośnik w całości. B3. Modulatory środka aktywnego Modulatory środka aktywnego są również rozważane jako związane chemiczne cząstki. Korzystny modulator środka aktywnego jest modulatorem ureazy. Określenie "modulator ureazy" oznacza bądź inhibitor ureazy bądź środek zwiększający aktywność ureazy. Modulator w kompozycjach (np. kompozycjach farmaceutycznych) zgodnie z powyższym może być wybrany ze wszystkich lub z części sekwencji polinukleotydu ureazy, antysensowych cząsteczek ureazy, polipeptydów ureazy, białka, peptydu, lub organicznych modulatorów aktywności biologicznej ureazy, takich jak inhibitory, związki antagonistyczne (obejmujących przeciwciała) lub agonistyczne. Korzystnie, modulator jest aktywny w leczeniu stanu, w którym pośredniczy, lub który jest łagodzony przez ekspresję ureazy lub aktywność ureazy. "Inhibitor ureazy" obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek, które wpływają na: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy: lub (2) jedną lub więcej z normalnych funkcji ureazy, obejmujących hydrolizę mocznika prowadzącą do utworzenia H karbaminianu i amoniaku. Inhibitor "działa bezpośrednio na ureazę", gdy inhibitor wiąże się z ureazą przez elektrostatyczne lub chemiczne oddziaływania. W takich oddziaływaniach mogą lub nie pośredniczyć inne cząsteczki. Inhibitor działa "pośrednio na ureazę", gdy jego najbardziej bezpośredni wpływ jest działaniem na cząsteczki inne niż ureaza, które wpływają na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy. Inhibitory ureazy służą do spowolniania przekształcenia mocznika w jony amonowe. Inhibitory ureazy obejmują nie ograniczając zakresu pochodne kwasu hydroksamowego (np. kwasu acetohydroksamowego), pochodne fosforamidowe (np. flurofamid), fosforany, tiole (np. 2-merkaptoetanol itp.), kwas borny, związki halogenowe (np. fluorki itp.), i ekstrakt z kory cynamonowca chińskiego. Dalsze