BADANIA KLINICZNE. Charakterystyka pięciu różnych powierzchni implantów i ich wpływu na orientację: badanie na psach. Informacja wprowadzająca

Transkrypt

1 BADANIA KLINICZNE Paulo Coelho ESTEVAM BONFANTE Charakterystyka pięciu różnych powierzchni implantów i ich wpływu na orientację: badanie na psach Characterization of 5 different implant surfaces and their effect on osseointegration: study in dogs. Paulo G. Coelho PhD1, Estevam A. Bonfante PhD2, Roberto S. Pessoa PhD3, Charles Marin PhD4, Rodrigo Granato PhD4, Gabriela Giro PhD3, Łukasz Witek MS1, Marcelo Suzuki DDS5 1 Department of Biomaterials and Biomimetics, New York University, New York, NY, USA 2 Department of Prosthodontics, University of Säo Paulo - Bauru School of Dentistry, Bauru, SP, Brazylia 3 Department of Oral Diagnosis and Surgery, Universidade Estadual Paulista Jülio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia de Araraquara, Araraquara, SP, Brazylia 4 Department of Dentistry, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazylia 5 Department of Prosthodontics, Tufts University School of Dental Medicine, Boston, MA, USA Estevam A. Bonfante, AI. Octavia Pinheiro Brisola, Bauru - SP - Brasil , Phone: , estevamab@gmail.com Słowa kluczowe: powierzchnia implantu, in vivo, moment obrotowy, histologia, osteointegracja Key words: implant surface, in vivo, torque, histology, osseointegration Informacja wprowadzająca Chemiczna modyfikacja powierzchni implantów jest kojarzona ze zmianami w zakresie topografii powierzchni, które mogą mieć wpływ na wczesny proces osteointegracji. Celem niniejszego badania było określenie na modelu zwierzęcym wpływu kontrolowanych zmian w obrębie powierzchni implantu na wczesny proces osteointegracji. Metodologia Ocenie poddano pięć rodzajów powierzchni implantów: piaskowaną tlenkiem glinu (Alumina-Blasted), piaskowaną biologicznie (Biological Blasting), pokrytą plazmą (Plasma), mikropiaskowaną resorbowalnym środkiem (Microblasted-resorbable blasting media - microblasted RBM) oraz piaskowaną tlenkiem glinu i wytrawianą (Alumina-Blasted/Acid-Etched - AB/ AE). Topografię powierzchni scharakteryzowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, optycznej interferometrii, a skład chemiczny poddano analizie wykorzystując fotoelektronową spektroskopię rentgenowską (XPS). Implanty wprowadzono w kość promieniową sześciu psów i pozostawiono na 2 lub 4 tygodnie in vivo. Po przeprowadzeniu eutanazji badan implanty były wykręcane momentem obrotowym powodującym zerwanie połączenia z kością, a następnie były poddawane w formie nieodwapnionej badaniom histomorfologicznym oraz oceniano kontakt kości z implantem (BIC - z ang. bone-to-implant contact) i części powierzchni zajęte przez kość (BAFO z ang. bone area fraction occupied). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA (p<0,05), oraz testów post-hoc Tukeya. Streszczenie Abstract 2

2 BADANIA KLINICZNE Wyniki Dla powierzchni piaskowanej tlenkiem glinu wykazano najwyższe wartości średniej szorstkości powierzchniowej (Sa) i średniej wartości pierwiastka kwadratowego z pola powierzchni (Sq), podczas gdy parametry te miały najniższe wartości dla powierzchni piaskowanej biologicznie, a średnie dla powierzchni piaskowanej i wytrawianej (AB/AE). Powierzchnie pozostałe prezentowały wartości pośrednie pomiędzy zanotowanymi dla powierzchni piaskowanej biologicznie i piaskowanej/wytrawianej. Widma XPS wykazały obecność Ca i P na powierzchniach piaskowanych biologicznie oraz mikropiaskowanych, a najwyższy poziom O zanotowano dla powierzchni pokrytej plazmą, mikropiaskowanej i piaskowanej/wytrawianej. Zaobserwowano istotnie wyższe wartości momentu obrotowego po okresie 2 tygodni dla powierzchni mikropiaskowanej RBM (p<0,04), ale po okresie 4 tygodni nie stwierdzono różnic pomiędzy badanymi powierzchniami (p>0,74). Nie zaobserwowano istotnych różnic w wartościach parametrów BIC i BAFO po upływie 2 i 4 tygodni. Wnioski Wszystkie pięć badanych rodzajów powierzchni posiada właściwości osteokondukcyjne i zapewnia wysoki stopień osteointegracji i zamocowania biomechanicznego. Na przestrzeni ostatnich czterech dziesięcioleci wykazano wysoki odsetek przetrwania implantów (często przekraczający 95% po upływie 10 lat [1,2], dzięki czemu kliniczna implantologia stomatologiczna jest uważana za jedną z najpewniejszych metod leczenia stomatologicznego. Ten wysoki odsetek powodzenia klinicznego przypisywany jest doskonałej biokompatybilności tytanu, która umożliwia zaistnienie ścisłej interakcji powierzchni implantu z kością widocznej w powiększeniu mikroskopu optycznego, nazywanej osteointegracją [3-5]. Chociaż wszczepy śródkostne cechują się wysokim odsetkiem przetrwania w wymiarze długoczasowym, to wyniki ostatnich badań wskazują na znaczenie modyfikacji ich kształtu na różnym poziomie (tzn. w zakresie nano-, mikro- i makrogeometrii) tak, aby poprawić wczesną odpowiedź tkanek gospodarza na implant. Takie potencjalne skrócenie czasu gojenia może skutkować zawężeniem ram czasowych leczenia implantologicznego, tak że okluzyjnie funkcjonalne uzupełnienia protetyczne mogłyby być zakładane na wczesnych etapach po implantacji [6-8]. Spośród możliwych modyfikacji konstrukcji implantów, które mają za zadanie poprawę odpowiedzi tkanek gospodarza na implant, najwięcej uwagi w badaniach naukowych poświęca się modyfikacji ich powierzchni [3-8]. Podstawą do działań zmierzających do modyfikacji w powierzchni implantów jest fakt, że powierzchnia implantu najwcześniej wchodzi w interakcję z płynami ustrojowymi, wpływając potencjalnie na kaskadę procesów, które doprowadzają do gojenia kości oraz jej apozycji w najbliższym otoczeniu implantu [9]. W wielu opublikowanych do tej pory artykułach o charakterze przeglądu piśmiennictwa podejmowano tematykę rozmaitych możliwości modyfikacji w zakresie powierzchni implantów i panuje ogólne przekonanie, że zarówno szorstkość powierzchni (w porównaniu do powierzchni gładkich), jak i ich chemiczna modyfikacja (dodatek bioceramiki na bazie Ca-P w różnych postaciach w porównaniu do powierzchni nieuzdatnionych) sprzyjają zaistnieniu wczesnej odpowiedzi tkanek gospodarza na implant. Z historycznego punktu widzenia, powierzchnie implantów dentystycznych ewoluowały od zupełnie gładkich do powierzchni o szorstkiej teksturze, a wyniki najnowszych badań skłaniają się ku chemicznej modyfikacji powierzchni umiarkowanie szorstkich [4-6,10,11]. Na przestrzeni czasu zainteresowanie budziły zarówno topograficzne, jak i chemiczne modyfikacje powierzchni implantów [4-6,10,11], ponieważ zarówno jedne, jak i drugie, dawały obiecujące wyniki w badaniach in vitro oraz in vivo [13-20] w porównaniu do swoich poprzedników o umiarkowanie szorstkich powierzchniach. Poprawę właściwości powierzchni uzyskiwano poprzez zmiany zwilżalności powierzchni [21], impregnację Ca i P warstwy tlenku tytanu [18], depozycję bioaktywnej ceramiki [19,20, 22], oraz poprzez inkorporację innych cząstek chemicznych, takich jak na przykład fluorki [11, 23]. Ponieważ chemiczne modyfikacje powierzchni skutkują typowo zmianami ich tekstury powstającymi w procesie obróbki, to kontrolowanie takich zmiennych, tak by osiągnąć jak najlepsze wyniki procesu gojenia, jest zadaniem trudnym, w związku z czym pożądane jest obszerne, bezpośrednie porównanie różnych rodzajów powierzchni na odpowiednim modelu in vivo. Dlatego też w niniejszym badaniu przeprowadzono porównanie biomechaniczne i histomorfometryczne efektów różnych modyfikacji powierzchni na modelu zwierzęcym. MATERIAŁY I METODOLOGIA W badaniu wykorzystano implanty śrubowe Ti-6Al-4V o średnicy 3,75 mm i długości 8 mm, dostarczone przez producenta (AB Dental). W sumie zastosowano 75 implantów, które zostały podzielona na pięć grup według sposobu modyfikacji powierzchni: piaskowane tlenkiem glinu (Alumina-Blasted), piaskowane biologicznie (Biological Blasting), pokryte plazmą (Plasma), mikropiaskowane (Micorblasted resorbable blasting media - microblasted RBM) oraz piaskowane/wytrwiane (Alumina-Blasted/ Acid-Etched - AB/AE). Trzy implanty z każdej grupy wykorzystano do charakterystyka powierzchni. Charakterystyka powierzchni Powierzchnie implantów scharakteryzowano przy pomocy trzech różnych metod (n=3 implanty o danym typie modyfikacji powierzchni). W pierwszej kolejności przeprowadzono badanie za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej (Phillips XL 30) (SEM) w różnych powiększeniach przy napięciu przyspieszającym 15kV, by zaobserwować topografię danych rodzajów powierzchni implantów. Kolejnym etapem było określenie parametrów szorstkości z wykorzystaniem interferometrii optycznej (Phase View 2.5 ) (IFM). Trzy implanty, po jednym z każdego rodzaju powierzchni, poddano ocenie w płaskim obszarze ich krawędzi tnących (trzy pomiary na każdy implant). Wyznaczono parametr Sa (średnia arytmetyczna wartości całkowitych wysokości powierzchni w badanym obszarze) oraz Sq (średni pierwiastek kwadratowy z wartości całkowitych różnic wysokości powierzchni w badanym obszarze) [24,25]. Aby oddzielić szorstkość od pofalowania powierzchni dla cyfrowych pomiarów 3D na skali mikrometrowej, zastosowano wysokoprzepustowy filtr Gaussa o wymiarach 250µm x 3

3 250µm. Po wykonaniu analizy zgodności z rozkładem normalnym, przeprowadzono analizę statystyczną za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA, przyjmując poziom istotności 95%. Trzecią procedurą była specyficzna ocena składu chemicznego powierzchni przeprowadzona za pomocą fotoelektronowej spektroskopii rentgenowskiej (XPS). Implanty umieszczono w próżniowej komorze transferowej i odgazowano do 10-7 torra. Następnie przetransportowano próbki w warunkach próżni do spektrofotometru XPS. Widma XPS uzyskano przy pomocy koncentrycznego półsferycznego analizatora o średnim promieniu 165 mm, pracującym przy ciągłej wartości energii 160 ev do badania i 80 ev do skanów o wysokiej rozdzielczości. Kąt odbicia wynosił 90o, a wymiary badanego pola 150 µm x 150 µm. Powierzchnie implantów poddano ocenie w różnych miejscach (3 miejsca badania/implant). Model zwierzęcy zabieg chirurgiczny Po otrzymaniu zgody Komisji Bioetycznej ds. Badań na Zwierzętach Uniwersytetu Federalnego Santa Catarina pozyskano sześć psów mieszańców, które były następnie trzymane przez 2 tygodnie w zwierzętarni, zanim przystąpiono do pierwszej procedury chirurgicznej. Bezpośrednio przed zabiegiem, zanim uzyskano znieczulenie ogólne, podano trzy leki drogą iniekcji domięśniowej. Lekami tymi były: siarczan atropiny (0,044 mg/kg), chloran xylazyny (8 mg/kg) i chloran ketaminy (15 mg/kg). Miejscem implantacji była nasada kości promieniowej kończyny prawej, jeśli implanty wprowadzano na 4 tygodnie in vivo, lub lewej, jeśli implanty wprowadzano na 2 tygodnie in vivo. W celu wprowadzenia implantów u każdego zwierzęcia miejsce operacyjne zostało ogolone żyletką oraz odkażone roztworem jodyny. Wykonano cięcie skóry i okostnej na długości około 5 cm, po czym odpreparowano okostną, aby odsłonić kość. Implanty wkręcano ruchem ciągłym z prędkością obr./min, przy obfitym chłodzeniu roztworem soli fizjologicznej, zgodnie z zaleceniami producenta. Wszczepy zostały wprowadzone w takim rozmieszczeniu, by zminimalizować ich ukośne ustawienie w miejscach implantacji (miejsca 1 do 5 od okolicy proksymalnej do dystalnej) wzdłuż nasady kości promieniowej, tak by możliwa była ocena momentu obrotowego oraz analiza histomorfometryczna. Po wprowadzeniu implantów założono śruby gojące, a tkanki zeszyto warstwowo: okostną szwami wikrylowymi 4-0, a skórę nylonowymi 4-0. Zwierzęta pozostały w zwierzętarni; celem kontroli bólu i infekcji wprowadzono antybiotykoterapię (penicylina, jedn/kg) oraz leki przeciwzapalne (ketoprofen 1% 1ml/5kg). Po czterech tygodniach przeprowadzono eutanazję poprzez przedawkowanie leków znieczulających/usypiających, a kończyny oddzielono wykonując ostre cięcie. Celem oceny momentu obrotowego podczas wykręcania zamocowano kość promieniową w urządzeniu służącym do elektronicznego pomiaru momentu obrotowego wyposażonym w komórkę mierzącą obciążenie do 500 Ncm3. Zastosowano narzędzia indywidualnie dopasowane do wewnętrznego połączenia każdego implantu, a blok kostny umieszczono ostrożnie, tak by uniknąć przemieszczenia próbki w trakcie testu. Implanty były wykręcane w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara z prędkością ~0,196 radianów/min, dopóki nie zanotowano spadku wartości maksymalnej o 10%, i dla każdej próbki wyznaczono krzywą zależności przemieszczenia od momentu obrotowego. Uzasadnieniem takiego postępowania była konieczność zminimalizowania ewentualnych uszkodzeń w obszarze interfejsu (poł. kości z implantem) przed przystąpieniem do badań histologicznych [13,14]. Następnie przesłano implanty pozostające w kości do analizy histomorfometrycznej. Implanty w kości zostały zredukowane do małych bloczków, po czym zanurzono je na 24 godziny w 10% roztworze zbuforowanej formaliny. Bloczki poddano następnie płukaniu w bieżącej wodzie przez kolejne 24 godziny i stopniowemu odwadnianiu w roztworach alkoholu etylowego o wzrastającym stężeniu od 70 do 100%. Po odwodnieniu bloczki zostały zatopione w żywicy na bazie metakrylanu 1 zgodnie z instrukcją producenta. Bloczki pocięto następnie na cienkie warstwy (o grubości ~300 µm) za pomocą precyzyjnej piły z nasypem diamentowymɫ, wzdłuż osi długiej implantu, w kierunku zorientowanym na jego środek. Przekroje te zostały następnie przyklejone do płytek akrylowych cementem na bazie akrylanu, a po upływie 24 godzin wymaganych do związania cementu, przystąpiono do szlifowania i polerowania. Przekrojom nadano ostateczną grubość wynoszącą ~30 µm poprzez abrazję papierem ściernym3 (o wzrastającej ziarnistości nasypu: 400, 600, 800, 1200, 2400) na szlifierce, stosując chłodzenie wodne [26]. Przekroje wybarwiono następnie błękitem toluidynowym i przesłano do badania pod mikroskopem optycznym celem oceny histomorfologicznej. Kontakt kość implant (bone-to-implant contact, BIC) oceniono w powiększeniu 50X 200X przy pomocy oprogramowania komputerowego 5. Obszary kontaktu kości z implantem wzdłuż obwodu wszczepu zostały odjęte od wartości całkowitego obwodu wszczepu, po czym obliczono wartość parametru BIC. Część powierzchni zajętej przez kość (bone area fraction occupied - BAFO) pomiędzy gwintami wszczepu a beleczkami kości gąbczastej oceniono w powiększeniu 100X przy pomocy oprogramowania komputerowego. Obszary wszczepu zajęte przez kość odjęto od całkowitego pola pomiędzy gwintami, po czym wyznaczono wartość parametru BAFO (wyrażonej w procentach części powierzchni zajętej przez kość) [27]. Wstępna analiza statystyczna nie wykazała różnic wynikających z miejsca implantacji (pozycje od 1 do 5 wzdłuż kości promieniowej) na żaden z badanych parametrów. Dlatego też pominięto ten parametr w dalszej analizie statystycznej. Do oceny zależności statystycznej pomiędzy momentem obrotowym a zerwaniem połączenia z kością (interfejsu), BIC oraz BAFO wykorzystano jednokierunkowy test ANOVA. Za istotne statystycznie przyjęto wyniki o wartości p mniejszej od 5%, a analizę post hoc przeprowadzono za pomocą testu LSD Fischera. WYNIKI Wszystkie obrazy powierzchni implantów z mikroskopu elektronowego są przedstawione na Rycinach 1 i 2, a reprezentacyjne trójwymiarowe rekonstrukcje IFM pól o wymiarach 250 µm x 250 µm na Rycinie 3. Odpowiednie wartości parametrów Sa i Sq są przedstawione na Rycinie 4A. Na poziomie średniego oraz dużego powiększenia, jak również na rekonstrukcjach IFM (Rycina 3) zaobserwowano różnice morfologiczne w teksturze powier- 4

4 zchni implantów pomiędzy badanymi grupami. Podczas gdy podobną morfologię zaobserwowano dla powierzchni piaskowanej tlenkiem glinu, mikropiaskowanej oraz piaskowanej/wytrawianej, to obrazy elektronowej mikroskopii skaningowej wykazały, że powierzchnie piaskowane biologicznie posiadają rejony szorstkie powstałe w wyniku procedury piaskowania, wraz z rejonami gładkimi z rowkami powstałymi podczas procesu produkcji. Powierzchnie plazmowe prezentowały morfologię szorstką, ale, w porównaniu do powierzchni innych grup, o zaokrąglonym zarysie (Rycina 1 E i F). Resztkowe cząsteczki środków piaskujących były widoczne jedynie na powierzchniach piaskowanych tlenkiem glinu oraz piaskowanych biologicznie (Rycina 1 C i D). Wykazano istotne statystycznie różnice w wartościach parametrów Sa i Sq w pomiarach metodą IFM (Rycina 4 A i B), gdzie najwyższą wartość zanotowano dla powierzchni piaskowanej tlenkiem glinu, najniższą dla piaskowanej biologicznie, a pośrednią dla piaskowanej/wytrawianej. Pozostałe typy powierzchni prezentowały wartości pośrednie pomiędzy wartościami powierzchni piaskowanych biologicznie i piaskowanych/wytrawianych (różnice nieistotne statystycznie pomiędzy grupami) (Ryciny 4 A i B). Za pomocą widm XPS oceniono obecność pierwiastków Al, P, Ca, N, Ti, C, V, O oraz Na we wszczepach o badanych rodzajach powierzchni (Ryciny 4A i C). Najwyższą zawartość glinu (Al) zaobserwowano dla powierzchni piaskowanej tlenkiem glinu. Najwyższą zawartość wapnia (Ca) i fosforu (P) zaobserwowano dla powierzchni piaskowanej biologicznie, następnie dla powierzchni mikropiaskowanej zawartość tych pierwiastków była już znacznie niższa, natomiast dla pozostałych badanych powierzchni nie wykazano obecności tych pierwiastków. Nie wykryto tytanu (Ti) dla powierzchni pokrytej plazmą, a drugą najniższą zawartość Ti wykazano dla powierzchni piaskowanej biologicznie. Największą zawartością węgla (C) charakteryzowały się powierzchnie pokryta plazmą oraz piaskowana tlenkiem glinu, a najwyższą zawartość tlenu (O) wykazano dla powierzchni pokrytej plazmą, mikropiaskowanej oraz piaskowanej/wytrwianej (Rycina 4A i C). W czasie zabiegu chirurgicznego oraz w okresie obserwacji pozabiegowej nie zaobserwowano żadnych powikłań związanych z samą procedurą, infekcją pozabiegową czy jakichkolwiek innych. Z badania nie wykluczono żadnego implantu z powodu niestabilności klinicznej w czasie bezpośrednio po eutanazji. Wyniki testów biomechanicznych wykazały, że wartość zerwania interfejsu pod wpływem działania momentu obrotowego była istotnie statystycznie wyższa dla implantów o powierzchni micropiaskowanej w porównaniu do innych testowanych powierzchni w okresie pierwszych 2 tygodni (p<0,04), ale dla okresu 4-tygodniowego nie wykazano różnic pomiędzy implantami o różnych typach powierzchni (p>0,74) (Rycina 5 A i B). Badania na nieodwapnionych próbkach wykonane po kontrolowanych testach działania momentem obrotowym wykazały ścisły kontakt kości z badanymi rodzajami powierzchni implantów w obrębie kości zbitej oraz beleczkowej. Obserwacja okolicy połączenia kości z powierzchnią implantu w większym powiększeniu wykazała, że przekroje nieodwapnione, które zostały poddane opisanym testom biomechanicznym, wykazały minimalne odkształcenie w zakresie morfologii przez rozerwanie kości w wyniku testów mechanicznych (Rycina 6). Ocena jakościowa cienkich skrawków wybarwionych błękitem toluidyny nie wykazała występowania różnic morfologicznych in vivo pomiędzy badanymi powierzchniami po upływie zarówno 2 tygodni (Rycina 6 A, B i C) jak i 4 tygodni (Rycina 6 D, E i F) po upływie obu czasów obserwacji widoczny był ścisły kontakt pomiędzy wszczepem a kością korową (Rycina 6 A, B, D i E) oraz beleczkową (Rycina 6 C i F). Dodatkowo, zaobserwowano różnorodne wzorce gojenia wzdłuż wszczepu, zależne od interakcji pomiędzy geometrią implantu a wymiarami zastosowanych instrumentów chirurgicznych. W okolicy implantu, gdzie wewnętrzna średnica gwintu była większa lub równa wymiarowi ostatniego użytego wiertła chirurgicznego, umożliwiając tym samym powstanie ścisłego kontaktu pomiędzy powierzchnią implantu a kością korową już bezpośrednio po implantacji, pomiędzy 2-gim (Rycina 6 A) i 4-tym (Rycina 6 D) tygodniem doszło in vivo do wyraźnego remodelingu kości otaczającej wszczep dla wszystkich badanych powierzchni. Podczas gdy po okresie 2 tygodni można było zaobserwować in vivo proces przebudowy starej kości wraz z pojawianiem się nowego utkania kostnego (Rycina 6 A), to po upływie 4 tygodni nowe utkanie kostne było wyraźnie widoczne w rejonie kości przylegającej bezpośrednio do powierzchni implantu (Rycina 6 D). W miejscach, gdzie powstała komora gojąca poprzez wypreparowanie przestrzeni pomiędzy zewnętrznym wymiarem instrumentu chirurgicznego, a wewnętrznym wymiarem nagwintowania, proces tworzenia nowego utkania kostnego zachodził na całej przestrzeni komory gojącej oraz bezpośrednio na powierzchni implantu już w okresie 2 tygodniowej obserwacji in vivo (Rycina 6B). Po upływie 4 tygodni, na całej przestrzeni komory gojącej utkanie nowej kości uległo organizacji w blaszki kostne (Rycina 6E). W obszarach kości gąbczastej obserwowano formowanie się nowego utkania kostnego po okresie 2 tygodni (Rycina 6 C), a proces organizacji tego utkania w blaszki kostne był widoczny po okresie 4 tygodni (Rycina 6 F) w otoczeniu wszczepów o wszystkich badanych rodzajach powierzchni. Wyniki badań histomorfometrycznych nie wskazały występowania istotnych statystycznie różnic pomiędzy badanymi rodzajami powierzchni dla parametrów BIC oraz BAFO zarówno po 2, jak i po 4 tygodniach in vivo (BIC odpowiednio p>0,26 i p>0,09; BAFO odpowiednio p>0,94 i p>0,09 Ryciny 5 C, D, E i F). DYSKUSJA Powierzchnie implantów ewoluowały od zupełnie gładkich w kierunku uważanych dziś za standard powierzchni szorstkich, wytwarzanych różnymi metodami, wśród których zawierają się również metody, które zostały wykorzystane do modyfikacji powierzchni implantów podlegających ocenie w niniejszym badaniu [6]. W porównaniu do wyników innych badań, uzyskane przez nas wartości szorstkości powierzchni były wyższe przez zastosowanie filtra o większym rozmiarze do pomiarów IFM (im mniejszy filtr, tym niższe wartości Sa oraz Sq [28]). Niemniej jednak względne różnice pomiędzy grupami są zgodne z wynikami wcześniej publikowanych badań [4,5]. Podczas gdy powierzchnia piaskowana tlenkiem glinu cechowała się szorstką teksturą, a zarazem zatopionymi w niej cząsteczkami środków zastosowanych do piaskow- 5

5 ania, to powierzchnia piaskowana/wytrawiana była umiarkowanie szorstka oraz pozbawiona cząsteczek piaskujących, wskazując na skuteczność wytrawiania kwasem w dalszych procesach oczyszczania powierzchni po wypiaskowaniu. Chociaż zarówno powierzchnia piaskowana biologicznie, jak i mikropiaskowana zostały wypiaskowane substancjami resorbowalnymi, to zastosowanie różnej aparatury oraz innego sposobu oczyszczania powierzchni spowodowały powstanie różnic w szorstkości i składzie chemicznym, co jest typowe przy inkorporacji cząsteczek bioaktywnej ceramiki na bazie Ca i P. Po pierwsze, z powodu mniejszej twardości resorbowalnego środka piaskującego w porównaniu do tlenku glinu, zanotowano niższy stopień szorstkości tej powierzchni niż powierzchni piaskowanej Al2O3 i piaskowanej/wytrawianej. Po drugie, obserwacja obrazów powierzchni piaskowanej biologicznie oraz mikropiaskowanej z mikroskopu elektronowego wykazała bardziej jednolite rozprowadzenie ziarnistości na powierzchni mikropiaskowanej typu RBM, na której również, w przeciwieństwie do powierzchni piaskowanej biologicznie, nie zaobserwowano takich miejsc, gdzie rowki powstałe w procesie produkcji byłyby widoczne pomiędzy ziarnistościami. Po trzecie, zastosowanie różnych procedur po wypiaskowaniu przyczyniło się do obecności cząsteczek Ca-P na powierzchni piaskowanej biologicznie i wysokiej zawartości tych pierwiastków wykazanej za pomocą widm oraz chemicznej impregnacji [10] cząsteczek Ca i P na powierzchni mikropiaskowanej. Chociaż nie podano informacji dotyczących składu źródła plazmy oraz temperatury obróbki, to z obrazów mikroskopii elektronowej wynika, że powierzchnie te zostały najpierw wypiaskowane oraz że proces nanoszenia plazmy wpłynął na stopień szorstkości powierzchni. Poparciem dla tego przypuszczenia jest obraz powierzchni z zaokrąglonymi strukturami, w porównaniu do ostrych zarysów szczytów i dolin na pozostałych powierzchniach. Dodatkowo, poprzez zastosowanie tej metody uzyskano wyraźną zmianę w zakresie składu pierwiastkowego powierzchni tytan (Ti) nie został wykryty, natomiast zawartość węgla (C) oraz tlenu (O) były podwyższone. Taka zmiana składu chemicznego powierzchni może być wynikiem wyraźnego zwiększenia powierzchniowej warstwy tlenków lub wzrostu energii powierzchniowej, co mogło skutkować absorpcją związków węgla z atmosfery podczas procesu obróbki próbek. Wyniki badania zerwanego interfejsu pod wpływem działania siły obrotowej wykazały wysokie wartości zamocowania biomechanicznego dla implantów o wszystkich badanych powierzchniach po okresie 2 tygodni (istotnie statystycznie wyższe dla powierzchni mikropiaskowanej RBM w porównaniu do pozostałych) oraz ogólny wzrost wartości tego parametru dla wszystkich badanych powierzchni po okresie 4 tygodni (brak istotnych różnic pomiędzy grupami). Takie wyniki, jakie uzyskano po okresie wynoszącym 2 tygodnie, wskazują, że stopień szorstkości oraz skład chemiczny powierzchni mikropiaskowanej RBM sprzyjają wczesnej odpowiedzi tkanek gospodarza na implant, oraz że krótko po tym czasie obserwacji nie wykazano już istotnych różnic dzięki dobrym właściwościom osteokondukcyjnym oraz biokompatybilności pozostałych badanych powierzchni. Mały wymiar mechanicznego uszkodzenia ciągłości pomiędzy kością a implantem obserwowany na preparatach histologicznych wykonanych po testach wytrzymałości mechanicznej był prawdopodobnie spowodowany odpowiednim ustawieniem próbek i powolną, kontrolowaną wartością momentu obrotowego. Dlatego też mechaniczne rozerwanie połączenia między implantem a kością było widoczne tylko na kilku przekrojach histologicznych i nie wpłynęło na ocenę histomorfologiczną czy histomorfometryczną [13, 14, 17]. Generalnie rzecz biorąc, wyniki badania histologicznego przekrojów wykazały, że wszystkie badane powierzchnie były biokompatybilne i posiadały właściwości osteokondukcyjne kość znajdowała się w ścisłym kontakcie z powierzchniami implantów w rejonie kości korowej i gąbczastej. Z morfologicznego punktu widzenia nie zaobserwowano różnic pomiędzy badanymi rodzajami powierzchni. Utkanie nowej kości było widoczne wokół implantów o wszystkich typach powierzchni po okresie obserwacji wynoszącym 2 i 4 tygodnie, a początkowa organizacja nowego utkania w blaszki kostne miała miejsce dla wszystkich rodzajów powierzchni. W przypadku powierzchni piaskowanej tlenkiem glinu i mikropiaskowanej RBM, w obu okresach obserwacji, nie wykazano jakiegokolwiek szkodliwego działania, które potencjalnie mogło być spowodowane obecnością cząsteczek środków wykorzystanych do piaskowania. Zależnie od rejonu wszczepu oraz wzajemnej relacji jego wymiarów do wymiarów instrumentarium chirurgicznego, zaobserwowano różne wzory gojenia wzdłuż implantu. W miejscach, gdzie ścisły kontakt kości korowej z powierzchnią implantu występował już bezpośrednio po implantacji, zaobserwowano gojenie przez apozycję nowej kości [16, 27, 29]. Taki sposób gojenia polega na remodelingu kości w okolicy przylegającej do wszczepu z następową apozycją nowego utkania kostnego w ścisłym kontakcie z powierzchnią implantu [16, 27, 29], co zostało zaobserwowane dla wszystkich badanych grup powierzchni po 2 i 4 tygodniach. Taka sekwencja procesów przebudowy kostnej skutkuje typowo wysokim stopniem pierwotnej stabilności implantu [27]. Z drugiej jednak strony, kiedy w wyniku wzajemnej relacji geometrii implantu i wymiarów instrumentarium chirurgicznego doszło do powstania komór gojących, zaobserwowano wzór gojenia przypominający kość pochodzenia błoniastego [16, 27, 29]. Wcześniej wykazano, że komory gojące szybko wypełniają się nowym utkaniem kostnym na całej przestrzeni zajętej przez skrzep krwi, który formuje się bezpośrednio po wprowadzeniu implantu, co zapewnia osteointegrację [16, 17, 27, 29, 30]. Uzyskane przez nas wyniki wykazały, że w miejscach gdzie pomiędzy implantem a kością zbitą powstały komory gojenia, szybkie wypełnianie się tych przestrzeni nowym utkaniem kostnym miało miejsce jeszcze przed upływem 2 tygodni, a początkowa organizacja nowego utkania kostnego w blaszki kostne była obserwowana po upływie 4 tygodni, co pozostaje w zgodzie w wynikami wcześniej publikowanych badań. Taki sam trend morfologicznej ewolucji pierwotnego utkania w blaszki kostne był obserwowany w obszarze kości gąbczastej [31]. Podczas gdy nie wykazano istotnych różnic w wartościach parametrów BIC i BAFO, zaobserwowano ogólny ich wzrost w okresie od 2 do 4 tygodni in vivo, co świadczy o tym, że przyjęte w tym badaniu ramy czasowe pokrywały się z dynamicznym procesem gojenia, które ma miejsce we wczesnym etapie po implantacji. W obrębie uwzględnionych w badaniu grup, największy wzrost wartości BIC i BAFO w czasie zaobserwowano dla powierzchni piaskowanej biologicznie, dla której wartości średnie tych parametrów były po okresie 4 tygodni wyższe od pozostałych spośród badanych powierzchni. Prawdopodobną 6

6 przyczyną tego był wpływ wyższej zawartości Ca i P na tej powierzchni w porównaniu do innych powierzchni, co sugeruje też że obecność tych pierwiastków powoduje zmiany w dynamice procesu gojenia kości po implantacji [17-20, 32]. WNIOSKI Zależność pomiędzy makrogeometrią implantu i techniką chirurgiczną a pięcioma różnymi rodzajami powierzchni o właściwościach osteokondukcyjnych poskutkowało wysokim stopniem osteointegracji i mocowania biomechanicznego. Tworzenie poglądów na podstawie badania oceniającego pięć powierzchni o różnej teksturze i składzie chemicznym jest wprawdzie możliwe, to jednak jednoznaczne wskazanie, który z parametrów odpowiada za różnice wyników biomechanicznych i histomorfometrycznych, jest już niemożliwe. Konieczne są kolejne badania eksperymentalne analizujące te zmienne. Autorzy zapewniają o braku konfliktu interesów. Background: Implant surface chemical modification is typically associated with surface topographical alterations that may affect early osseointegration. This study investigated the effects of controlled surface alterations in early osseointegration in an animal model. Methods: Five implant surfaces were evaluated: Alumina-Blasted, Biological Blasting, Plasma, Microblasted-resorbable blasting media (microblasted RBM), and Alumina-Blasted/ Acid-Etched (AB/AE). Surface topography was characterized by scanning electron microscopy, and optical interferometry, and chemical assessment by x-ray photoelectron spectros copy (XPS). The implants were placed in the radius of 6 dogs, remaining 2 and 4 weeks in vivo. Following euthanization, specimens were torqued-to-interface failure, and nondecalcified processed for histomorphological, bone-to-implant con tact (BIC), and bone area fraction occupied (BAFO) evaluation. Statistical evaluation was performed by one-way ANOVA (p < 0.05), and post-hoc testing by the Tukey s test. Results: The alumina-blasted surface presented the highest average surface roughness (Sa) and mean root square of the surface (Sq) values, the biological blasting the lowest, and AB/AE an intermediate value. The remaining presented inter mediate values between the biological blasting and AB/AE. The XPS spectra revealed Ca and P for the biological blasting and microblasted RBM surface, and the highest 0 levels for the plasma, microblasted RBM, and AB/AE surfaces. Significantly higher torque was observed at 2 weeks for the microblasted RBM surface (p<0.04), but no differences existed be tween surfaces at 4 weeks (p >0.74).No significant differences in BIC and BAFO values were observed at 2 and 4 weeks. Conclusions: The five surfaces were osseoconductive and resulted in high degrees of osseointegration and biomechanical fixation. Over the last four decades, clinical oral implantology have shown high survival rates over time (often exceeding 95 /o over 10 years [1, 2] ), and has been regarded as one of the most successful treatment modalities in dentistry. Such high success rates have been attributed to the excellent biocompatibility of titanium that allow for intimate bone interaction at the optical microscopy resolution, regarded as osseointegration [3-5]. While high survival rates have been reported for endosseous devices, current research has emphasized towards implant design modification at various length scales (i.e.nano, micro, and macrogeometry) in desire to improve the early host im-plant tissue response [6]. Such potential decrease in healing time may result in reduction in treatment time frames through prosthetic restorations that could be placed in occlusal function at early implantation times [6-8]. Among implant design modifications attempting to improve the host-to-implant response, implant surface modifications have been the most investigated [3-8]. The rationale for surface modification lies upon the fact that it is the first part of the implant to interact with biofluids, potentially altering the cascade of events that leads to bone healing and intimate apposition with the device [9]. Several reviews cover the large number of possibilities included in implant surface modifications, and it is a general con sensus that both rough surfaces (over smooth turned surfaces) and surface chemistry (additions of Ca-P based bioceramics in various forms over non-coated surfaces) favor the early host-to-implant response [4-6]. From a historical perspective, dental implant surfaces evolved from the as-turned smooth surfaces towards textured rough surfaces, and recent research point towards chemistry modification of moderately rough surface [4-6,10,11]. From a temporal standpoint, both topographic and chemistry surface modifications have drawn attention [4-6,10,11] as both have been showing promising results in vitro [12] and in vivo models [13-20] relative to their moderately rough predecessors. Improvements have been achieved by alterations in surface wettability [21], impregnation of Ca and P onto the titanium oxide layer [18], deposition of discrete bioactive ceramics [19,20,22], and through minor incorporation of other chemical elements such as fluoride [11,23]. Since changes in surface chemistry typically result in surface texture during processing, controlling such variables in order to determine their relative effects in healing is a challenging task, and the largest direct comparison between various surfaces in a suitable in vivo model is desirable. Thus, the present study biomechanically and histomorphometrically evaluated the effect of various surface modifications in an animal model. MATERIALS AND METHODS The implants used in this study were Ti-6AI-4V screw type implants with 3.75 mm of diameter and 8 mm in length provided by the manufacturer (AB Dental). A total of 75 implants were used and divided in five groups according to surface treatment: Alumina-Blasted, Biological Blasting, Plasma, Microblasted resorbable blasting media (microblasted RBM), and Alumina-Blasted/Acid-Etched (AB/AE). Three implants from each group were used for surface characterization. Surface Characterization The surface characterization was accomplished with three different methods (n=3 implants per surface). First, scanning electron microscopy (SEM) was performed at various magnifications under an acceleration voltage of 15kV to observe the different groups surfaces topography. The second step was to determine the roughness parameters by optical interferometryt IFM). Three implants of each surface were evaluated at the flat region of the implant cutting edges (three measurements per implant) and Sa (arithmetic mean of the absolute values of the surface height within the sampling area) and Sq (root mean square of the surface departures within the sampling area) parameters determined [24, 25]. To separate roughness from waviness and shape for digital 30 measurements, on a micrometer scale, a high-pass Gaussian filter of 250 µm x 250 µm was utilized. Following data normality verification, sta tistical analysis at 95 % level of significance was performed by one-way ANOVA. The third procedure was the surface specific chemical assessment performed by x-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The implants were inserted in a vacuum transfer chamber and degassed to 10-7 torr. The samples were then transferred un der vacuum to the XPS spectrometer. Survey spectra were obtained using a 165 mm mean radius concentric hemispherical analyzer operated at constant pass energy of 160 ev for survey and 80 ev for high resolution scans. The take off angle was 90o and a spot size of 150 µm x 150 µm was used. The implant surfaces were evaluated at various locations (3 per implant). Animal Model and Surgical Procedure Following approval of Ethics Committee for Animal Research at Federal University of Santa Catarina, six mongrel dogs were acquired and remained for 2 weeks in the animal facility prior to the first surgical procedure. For surgery, three drugs were administered until general anesthesia achievement by intramuscular injection. The drugs were atropine sulfate (0.044 mg/kg), xilazine chlorate (8mg/kg) and Ketamine chlorate (15mg/ kg). The implantation site was the radius epiphysis. and the right limb of each animal provided implants that remained for 4 weeks in vivo, and the left limb provided 1implants that remained 2 weeks in vivo. For implant placement, the surgical site was shaved with a razor blade and was followed by application of antiseptic iodine solution. An incision of =5cm through the skin and periosteum was performed and the periosteum was elevated for bone exposure. Sequential drills were utilized following the manufacturer s recommendation under abundant saline irrigation at 1.200rpm. The implants were placed in an interpolated distribution to minimize bias from different implantation sites (sites 1 to 5 from proximal to distal) along the radial epiphysis for torque and histomorphometric evaluation. After placement the healing caps were inserted and sutured in layers with vicryl 4-0 for periosteum and nylon 4-0 for skin was performed. The animals stayed in animal care facility and received antibiotic (Benzyl Penicilin Benzatine UI/Kg) and antiinflammatory (Ketoprofen 1% 1ml/5Kg) medication to control the pain and infection. Euthanasia was performed after 4 weeks by anesthesia overdose and the limbs were retrieved by sharp dissection. For the torque testing, the radius was adapted to an electronic torque machine equipped with a 500 Ncm torque load cell. Custom machined tooling was adapted to each implant internal connection and the bone block was carefully positioned to avoid specimen misalignment during testing. The implants were torqued in counter clockwise direction at a rate of ~0,196 radians/min until a 10% decrease in maximum value was recorded, and a torque versus displacement curve was recorded for each specimen. The rationale for this procedure was to minimize interface damage prior to histological procedures [13-14]. The implants in bone were then referred to histomorphometric analysis. The implants in bone were reduced to blocks and were then immersed in 10% buffered formalin solution for 24h. The blocks were then washed in running water for 24h, and gradually dehydrated in a series of alcohol solutions ranging from % ethanol. Following dehydration, the samples were embedded in a methacrylate-based resin according to the manufacturer s instructions. The blocks were then cut into slices (~300 µm thickness) aiming the center of the implant along its long axis with a precision diamond saw glued to acrylic plates with an acrylate-based cement, and a 24h setting time was allowed prior to grinding and polishing. The sections were reduced to a final thickness of ~300 µm by means of a series of SiC abrasive papers (400, 600, 800, 1200 and 2400) in a granding/polishing machine under water irrigation [26]. The sections were then toluidine blue stained and referred to optical microscopy for histomorphologic evaluation. The bone-to-implant contact (BIC) was determined at 50X-200X magnification by means of a computer software. The regions of bone-to-implant contact along the implant perimeter were subtracted from the total implant perimeter, and calculations were performed to determine the BIC. The bone area fraction occupied (BAFO) between threads in trabecular bone regions was determined at 1OOX magnification by means of computer software. The areas occupied by bone were subtracted from the total area between threads, and calculations were performed to determine the BAFO (reported in percentage values of bone area fraction occupied)[27]. Preliminary statistical analyses showed no effect of implant site (i.e., there were no consistent effects of positions 1 to 5 along the radius) on all measurements. Therefore. site was not considered further in the analysis. Statistical evaluation of torque to interface fracture, BIC, and BAFO were performed by one-way ANOVA. Statistical significance was indicated by p-levels less than 5%, and post-hoc testing employed the Fisher LSD test. 7

7 RESULTS All implant surfaces electron micrographs are presented in Fig.s 1 and 2 and their representative 250 µm x 250 µm m IFM three-dimensional reconstructions, in Fig. 3. Their respective Sa and Sq values are presented in Fig. 4 A. The surface texture observed at intermediate and high magnification levels (Fig. 1 and 2), as well as the IFM reconstruction (Fig. 3) revealed morphologic differences between groups. While similar morphology was observed for the alumina-blasted, microblasted RBM, and AB/AE surfaces, scanning electron micrographs showed that the biological blasting presented rough regions from the grit-blasting procedure along with flat regions with the original as-machined grooves. The plasma group surface morphology presented a rough surface with rounded morphology compared to other groups (Fig. 1 E and F). Residual blasting media particles were observed on the alumina-blasting (Fig. 1 A and B) and biological blasting surfaces only (Fig. 1 C and D). The IFM measurements presented significant differences for both Sa and Sq values (Fig. 4 A and B), where the alumina-blasted surface presented the highest, the biological blasting the lowest, and AB/AE intermediate value. The other surfaces presented intermediate values between the biological blasting and AB/AE (non-significant between groups) (Fig. 4 A and 8). The XPS spectra evaluated the presence of AI, P,Ca,N, Ti, C, V,0, and Na for the different surfaces (Fig. 4 A and C). The highest aluminum concentration was observed for the alumina-blasting surface. The highest Ca and P concentra tion was observed for the biological blasting surface, followed by the microblasted RBM at much lower concentrations and all other surfaces without the presence of these chemical elements. No Ti was detected for the plasma treated surface, and the second lowest Ti value was observed for the biological blasting surface. The highest C values were observed for the plasma and alumina blasting surfaces, and the highest 0 levels were observed for the plasma, micro blasted RBM, and AB/AE surfaces (Fig. 4 A and C). The animal surgical procedures and follow-up demonstrated no complications regarding procedural conditions, post operative infection, or other clinical concerns. No implants were excluded from the study due to clinical instability immediately after the euthanization. The biomechanical testing results showed that significantly higher torque to interface fracture occurred for the microblasted RBM surface relative to others at 2 weeks (P<0.04), but that at 4 weeks no differences were observed between surfaces (p >0.74) (Fig. 5 A and B). The nondecalcified sample processing after controlled torque testing showed intimate bone contact with all implant surfaces at regions of cortical and trabecular bone. Higher magnification of the bone-implant interface region showed that the nondecalcified sections obtained following biomechanical testing presented minimal morphologic distortion due to mechanical testing bone disruption (Fig. 6). Qualitative evaluation of the toluidine blue stained thin sections revealed no morphologic differences between surfaces at 2 weeks (Fig. 6 A, B, and C) and 4 weeks (Fig.6 D, E, and F) in vivo, where intimate contact between cortical (Fig. 6 A, B, D, and E) and trabecular (Fig. 6 C and 6 F) bone were observed. In addition, different healing patterns were observed at different regions along the implant bulk, depending on the interplay between implant geometry and surgical instrumentation dimensions. At the region of the implant where the inner thread diameter was larger or equal the final surgical drilling dimension al lowing intimate contact between implant surface and cortical bone occurred immediately after implantation, substantial bone remodeling in proximity with the implant surface occurred between 2 (Fig. 6A) and 4 (Fig. 6D) weeks in vivo for all groups. While at 2 weeks in vivo old bone remodeling was observed along with regions of newly formed woven bone (Fig. 6A), at 4 weeks substantial woven bone was observed in proximity with the implant surface (Fig. 6D). At regions where a healing chamber was formed due to the formation of a space between the outer diameter of the surgical instrumentation and the inner diameter of the implant thread, woven bone formation was observed throughout the space of the chamber and directly onto the implant surface at 2 weeks in vivo (Fig. 6B). At 4 weeks. initial woven bone replacement by lamellar bone was observed throughout the healing chamber (Fig. 6E). At trabecular bone regions, newly formed woven bone was observed at 2 weeks (Fig. 6C), and initial woven bone replacement by lamellar bone was observed at 4 weeks (Fig. 6F) at regions in proximity with all implant surfaces. The histomorphometric results demonstrated no significant differences between surfaces for both BIC and BAFO at 2 and 4 weeks in vivo (BIC p>0.26 and p>0.09, respectively: BAFO p>0.94 and P>0.09, respectively- Fig.s 5 C,D,E, and F). DISCUSSION Implant surfaces have evolved from the smooth as-machined (as-turned) surfaces towards the now considered standard rough surfaces that are fabricated by a variety of methods, which include all those employed to fabricate the different surfaces evaluated in the present study6. Compared to published data, the obtained surface roughness values were higher due to the larger filter size utilized during IFM measurements (the smaller the filter, lower Sa and Sq values obtained28). Nonetheless, the relative differences between groups are in agreement with previously published work [4,5]. While the alumina blasting group presented a textured surface along with blasting media particles embedded on the surface, the AB/AE surface presented a reduced surface roughness, however without evidence of particle embedding in the surface, demonstrating the effectiveness of acid-etching on further cleaning the surface after blasting procedures. Specific to the incorporation of Ca- and P-based bioactive ceramics, although both the biological blasting and micro blasted RBM surfaces were blasted with resorbable blasting media, the blasting machinery and subsequent surface c leaning differences resulted in different textures and chemistries. First, due to the lower hardness of RBM compared to alumina, lower degrees of roughness were observed compared to both alumina blasting and AB/AE samples. Second, observation of the electron micrographs for the biological blasting and microsblasted RBM revealed more consistent spatial distribution of texture for the microblasted RBM surface, which unlike the biological blasting group did not show regions where machining grooves were apparent between textured regions. Third. different post-blasting procedures resulted in Ca-P particles throughout the biological blasting surface and high degrees of Ca and P on its surface chemistry spectrum, and chemical impregnation10 of Ca and P elements on the microblasted RBM surface. Although no detail was provided regarding the plasma source composition and temperature for the plasma group, it is apparent from the electron micrographs that the surface was previously blasted and that the texture was affected by the plasma processing. Such statements can be rationalized since rounded structures were observed compared to sharp defined peaks and valleys observed in all other groups. In addition, a substantial chemical shift was achieved by such method, where Ti was not detected along with increased C and 0 in the surface composition. This chemical shift may have originated from a substantialincrease in the surface oxide layer, or possibly by a high surface energy characteristic that may have readily adsorbed carbon-based species from the atmosphere during sample preparation. The torque to interface fracture results showed high biomechanical fixation values for all implant surfaces at 2 weeks (significantly higher for the microblasted RBM compared to other surfaces). and a general increase for all groups at 4 weeks (no significant differences between groups). Such result at 2 weeks showed that the microblasted RBM surface roughness and chemistry combination favored the early host-to-implant response, and that shortly after this observation period, no difference was evident due to the osseoconductive and biocompatible properties of other surfaces. The low degree of mechanical disruption between bone and implant observed in the histology slides following mechanical test ing was likely due to the proper specimen alignment and the slow controlled torque rate. Thus, mechanical disruption was observed only in a few histologic sections and did not compromise the histomorphologic and histomorphometric evaluations [13,14,17]. In general, results from the histologic sections showed that all of the surfaces investigated were biocompatible and osseconductive, presenting bone in close contact with the implant surface at regions of cortical and trabecular bone. From a morphologic standpoint no differences were observed between all surface investigated. Woven bone was observed around all surfaces at 2 weeks, and at 4 weeks, initial replacement of woven bone by lamellar bone was observed for all surfaces. No detrimental effect due to blasting media particle presence on the surface was observed for the alumina blasting and microblasted RBM groups at both implantation times. Specific to different regions of the implant and its relationship with the surgical drilling dimensions, different healing patterns were observed throughout the implant length. At regions where intimate contact between cortical bone and implant surface existed immediately after placement, an appositional bone healing was observed [16, 27, 29]. Such healing pattern comprises in interfacial remodeling with subsequent woven bone apposition in close contact with the implant surface [16, 27, 29], as observed sequentially for all groups at 2 and 4 weeks. This type of configuration typically results in high degrees of implant primary stability [27]. On the other hand, when the interplay between implant geometry and surgical drilling dimensions resulted in healing chamber formation. an intramembranous-like healing pattern was observed[16,27,29]. Healing chambers have been previously shown to be rapidly filled with woven bone throughout the volume occupied by the blood clot immediately after placement for osseointegration achievement [16,17,27,29,30]. In agreement with previous studies, the present results showed that in regions where healing chambers formed between implant and cortical bone. rapid woven bone filling occurred before or at 2 weeks, and initial remodeling comprising initial woven bone replacement by lamellar bone was observed by 4 weeks implantation time. The same morphologic evolution trend was observed at regions of trabecular bone [31]. While no significant differences were observed for both BIC and BAFO, a general increase was observed from 2 to 4 weeks in vivo, revealing that the time frames investigated in the present study was within the dynamic healing phases that occur at early implantation times. Within groups, the highest increase in BIC and BAFO values over time was ob served for the biological blasting group. which at 4 weeks presented the highest mean values for BIC and BAFO among all surfaces evaluated. Such observation was likely due to the effect of higher amounts of Ca and P elements on the surface relative to other groups, suggesting that their presence resulted in alteration in bone healing dynamics after implantation [17-20,32]. CONCLUSION The association of the implant macrogeometry and associated surgical technique with five different osseoconductive surfaces resulted in high degrees of osseointegration and biomechanical fixation. While insight can be provided by evaluating five surfaces with distinct texture and chemistry, pinpointing which of the surface parameters accounted for the differences in biomechanical and histomorphometric results,is not possible, experimental studies controlling these variables are warranted. The authors declare no conflict of interest. 8

8 Piśmiennictwo 1. Chuang SK, Tian L, Wei LJ, Dodson TB. Predicting dental implant survival by use of the marginal approach of the semi-parametric survival methods for clustered observations. J Dent Res;81: , Chuang SK, Wei LJ, Douglass CW, Dodson TB. Risk factors for dental implant failure: a strategy for the analysis of clustered failure-time observations. J Dent Res;81: , Albrektsson T, Gottlow J, Meirelles L,Ostman PO. Rocci A, Sennerby L. Survival of NobelDirect implants: an analysis of 550 consecutively placed implants at 18 different clinical centers. Clin Implant Dent Relat Res;9:65-70, Albrektsson T, Wennerberg A. Oral implant surfaces:part 1--review focusing on topographic and chemical properties of different surfaces and in vivo responses to them. lnt J Prosthodont;17: , Albrektsson T, Wennerberg A. Oral implant surfaces: Part 2--review focusing on clinical knowledge of different surfaces. lnt J Prosthodont;17: , Coelho PG,Granjeiro JM, Romanos GE, et al. Basic research methods and current trends of dental implant surfaces. J Biomed Mater Res B Appl Biomater;88: , Jimbo A, Ono D. Hirakawa Y, Odatsu T, Tanaka T, Sawase T. Accelerated Photo-Induced Hydrophilicity Promotes Osseointegration: An Animal Study. Clin Implant Dent Relat Res 2009 in press. 8. Jimbo A, Sawase T, Baba K. Kurogi T, Shibata Y, Atsuta M. Enhanced initial cell responses to chemically modified anodized titanium.clin Implant Dent Relat Res;10:55-61, Jimbo A, Sawase T, Shibata Y, et at. Enhanced osseointegration by the chemotactic activity of plasma fibronectin for cellular fibronectin positive cells. Biomaterials;28: n, Dohan Ehrenfest OM, Coelho PG, Kang BS, Sui YT, Albrektsson T. Classification of osseointegrated implant surfaces: materials, chemistry and topography. Trends Biotechnol;28: , Kang BS Sui YT, Oh SJ. Lee HJ, Albrektsson T. XPS, AES and SEM analysis of recent dental implants. Acta Biomater;5: , Moura CC, Souza MA,DechichiP, Zanetta-Barbosa 0, Teixeira CC, Coelho PG. The effect of a nanothickness coating on rough titanium substrate in the osteogenic properties of human bone cells. J Biomed Mater Res A;94: , Coelho PG, Cardaropoli G, Suzuki M, Lemons JE. Early healing of nanothickness bioceramic coatings on dental implants. An experimental study in dogs. J Biomed Mater Res B Appl Biomater;88: , Coelho PG, Lemons JE. Physico/chemical characterization and in vivo evaluation of nanothickness bioceramic depositions on alumina-blasted/acid-etched Ti-6AI-4V implant surfaces. J Biomed Mater Res A;90: , Coelho PG, Marin C, Granato A, Suzuki M. Histomorphologic analysis of 30 plateau root form implants retrieved after 8 to 13 years in function. A human retrieval study. J Biomed Mater Res B Appl Biomater;91: , Coelho PGt Suzuki M, Guimaraes MV, et al. Early bone healing around different implant bulk designs and surgical techniques: A study in dogs.clin Implant Dent Relat Res;12: , Granato A, Marin C, Suzuki M, Gil JN, JanalMN, Coelho PG. Biomechanical and histomorphometric evaluation of a thin ion beam bioceramic deposition on plateau root form implants: an experimental study in dogs. J Biomed Mater Res B Appl Biomater;90: , Marin C, Granato R, Suzuki M, Gil JN, Piattelli A, Coelho PG. RemovalTorque and Histomorphometric Evaluation of Bioceramic Grit-Blasted/Acid-Etched and Dual Acid-Etched Implant Surfaces:An Experimental Study in Dogs. J Periodontol:79: , Mendes VC, Moineddin R, Davies JE. The effect of discrete calcium phosphate nanocrystals on bone-bonding to titanium surfaces. Biomaterials;28: , Mendes VC, Moineddin A, Davies JE. Discrete calcium phosphate nanocrystalline deposition enhances osteoconduction on titanium-based implant surfaces. J Biomed Mater Res A;90: , Buser D, Broggini N, Wieland M, et al. Enhanced bone apposition to a chemically modified SLA titanium surface. J Dent Res; 83: , Orsini G, Piattelli M, Scarano A, et al. Randomized, controlled histologic and histomorphometric evaluation of im plants with nanometer-scale calcium phosphate added to the dual acid-etched surface in the human posterior maxilla. J Periodontal; 78: , Mendonca G. Mendonca DB. Aragao FJ. Cooper LF. Advancing dental implant surface technologyfrom micron- to nanotopography. Biomaterials; 29: , Leach A. Surface Topography Characterisation. In: Fundamental principles of engineering nanometrology: William Andrew Pub,: , Stout K, Sullivan P. Dong W. et al. Development of methods for the characterisation of roughness in three dimensions: Penton Pr; Donath K, Breuner G. A method for the study of undecalcified bones and teeth with attached soft tissues. The Sage Schliff {sawing and grinding) technique. J Oral Pathol;11: , Leonard G, Coelho P, Polyzois I, Stassen L, Claffey N. A study of the bone healing kinetics of plateau versus screw root design titanium dental implants. Clin Oral Implants Res; 20: , Wennerberg A, Albrektsson T. Suggested guidelines for the topographic evaluation of implant surfaces. lnt J Oral Maxillofac Implants;15: , Berglundh T,Abrahamsson I, Lang NP, Lindhe J. De novo alveolar bone formation adjacent to endosseous implants. Clin Oral Implants Res;14: , Coelho PG, Granato A, Marin C, Bonfante EA, Janal MN, Suzuki M. Biomechanical and bone histomorphologic evaluation of four surfaces on plateau root form implants: an experimental study in dogs. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radial Endod; 109:e39-45, Quaranta A, Iezzi G, Scarano A, et al. A histomorphometric study of nanothickness and plasmasprayed calcium phosphorous-coated implant surfaces in rabbit bone. J Periodontal; 81: , Meirelles L, Melin L, Peltola T, et al. Effect of hydroxyapatite and titania nanostructures on early in vivo bone response. Clin Implant Dent Aelat Res; 10: ,

9 10

10 11