4. Protokoły amplifikacji DNA przy użyciu systemu PowerPlex ESX 17

Transkrypt

1 4. Protokoły amplifikacji DNA przy użyciu systemu PowerPlex ESX 17 Materiały dostarczane przez użytkownika termocykler GeneAmp PCR System 9700 lub 2720 (Applied Biosystems) mikrowirówka probówki reakcyjne 0,2 ml MicroAmp lub płytka reakcyjna optyczna 96-dołkowa MicroAmp (Applied Biosystems) probówki mikrowirówkowe 1,5 ml końcówki do pipet z filtrem (patrz punkt 9.F) Poniższe protokoły stosujemy rutynowo do amplifikacji 0,5 ng matrycy DNA w objętości reakcji 25 µl. System PowerPlex ESX 17 został zoptymalizowany do pracy z termocyklerem GeneAmp PCR System Podano protokół amplifikacji dla termocyklera GeneAmp PCR Systems A. Ustawianie amplifikacji Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu zdecydowanie zaleca się stosowanie rękawiczek i końcówek do pipet odpornych na aerozole. Wszystkie odczynniki stosowane przed amplifikacją i po amplifikacji należy przechowywać w oddzielnych pomieszczeniach. Reakcje amplifikacji należy przygotowywać w sterylnym pomieszczeniu dedykowanym do przygotowywania reakcji. Stosować sprzęt i materiały przeznaczone do przygotowywania amplifikacji. Stężenie 9947A DNA określono na podstawie pomiaru absorbancji przy długości fali wynoszącej 260 nm. Oznaczenia ilościowe kontrolnego DNA przy użyciu innych metod, jak qpcr, mogą powodować otrzymanie różnych wartości. Dla każdego zestawu oznaczeń ilościowych należy przygotować świeży roztwór DNA. Rozcieńczonego DNA (np. 0,25 ng/µl lub mniej) nie należy przechowywać. 9947A DNA uzyskany z linii komórkowej wykazywać będzie nierównowagę alleli i nierównowagę między loci STR. Do analizy czułości nie należy używać DNA uzyskanego z linii komórkowej. Przed użyciem DNA do analizy czułości należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 C.! Aby amplifikacja się powiodła, należy zachować szczególną staranność. Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów z amplifikacją podano w punkcie 7.A. 1. Dokładnie rozmrozić mieszaninę podstawową PowerPlex ESX 5X Master Mix, mieszaninę par starterów PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix, 9947A DNA i wodę do amplifikacji. Uwaga: Odwirować probówki przez chwilę, aby ich zawartość opadła na dno, a następnie przed każdym użyciem przez 15 sekund mieszać odczynniki na mikrowytrząsarce. Nie odwirowywać mieszaniny par starterów 10X po pierwszym odwirowaniu, ponieważ w ten sposób startery mogą zgromadzić się na dnie probówki tworząc gradient. Strona 6

2 2. Określić liczbę reakcji do ustawienia. Należy uwzględnić reakcje kontroli dodatniej i ujemnej. Do tej liczby dodać jeszcze 1-2 reakcje, aby zrównoważyć błąd pipetowania. Pomimo tego, że w ten sposób zużywa się dodatkową objętość każdego odczynnika, gwarantuje to uzyskanie wystarczającej ilości mieszaniny do amplifikacji PCR we wszystkich próbkach. Ponadto, dzięki temu każda reakcja zawiera taką samą mieszaninę do amplifikacji PCR. 3. Umieścić na statywie po jednej czystej probówce reakcyjnej 0,2 ml na każdą reakcję i odpowiednio oznaczyć. Ewentualnie można użyć płytki MicroAmp, którą też należy odpowiednio oznaczyć. 4. Dodać ostateczną objętość każdego odczynnika podaną w tabeli 1 do jałowej probówki 1,5 ml. W tabeli 1 podano objętości składników na reakcję. Arkusz do obliczania wymaganej ilości każdego składnika mieszaniny do amplifikacji PCR podano w punkcie 9.D (tabela 5). Tabela 1. Mieszanina do amplifikacji PCR dla systemu PowerPlex ESX 17. Składnik mieszaniny do amplifikacji PCR 1 Objętość na reakcję Woda do amplifikacji do objętości końcowej 25,0 µl Mieszanina podstawowa PowerPlex ESX 5X Master Mix 5,0 µl Mieszanina par starterów PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix 2,5 µl matryca DNA (0,5 ng) 2,3 do 17,5 µl całkowita objętość reakcji 25 µl 1 Do probówki dodać najpierw wodę do amplifikacji, a następnie mieszaninę PowerPlex ESX 5X Master Mix i mieszaninę PowerPlex ESX 17 10X. Matryca DNA zostanie dodana w kroku 6. 2 Matrycę DNA przechowywać w wodzie wolnej od nukleaz lub buforze TE -4 (10 mm Tris- HCl [ph 8,0], 0,1 mm EDTA). Jeśli matryca DNA jest przechowywana w buforze TE, którego ph nie wynosi 8,0, lub zawiera wyższe stężenie EDTA, objętość dodawanego DNA nie powinna przekroczyć 20% ostatecznej objętości reakcji. Na wydajność i jakość amplifikacji PCR mogą znacznie wpływać zmiany ph (wskutek dodania Tris-HCl), stężenie dostępnego magnezu (wskutek chelatowania przez EDTA) lub inne inhibitory PCR, które mogą występować w niewielkim stężeniu zależnie od źródła matrycy DNA oraz zastosowanej procedury ekstrakcji. 3 Pozorne stężenie DNA może być różne w zależności od zastosowanej metody oznaczania ilościowego (13). Objętość matrycy DNA zalecana w tym przypadku opiera się na stężeniach DNA określonych na podstawie pomiaru absorbancji przy długości fali wynoszącej 260 nm. Zdecydowanie zalecamy przeprowadzenie eksperymentów mających na celu określenie optymalnego stężenia DNA w zastosowanej metodzie oznaczania ilościowego DNA. 5. Mieszać mieszaninę do amplifikacji PCR na mikrowytrząsarce przez 5-10 sekund, a następnie pipetą przenieść uzyskaną mieszaninę do każdej probówki reakcyjnej. Niewystarczające wymieszanie mieszaniny na mikrowytrząsarce może! doprowadzić do słabej amplifikacji lub nierównowagi między loci. Strona 7

3 6. Pobrać pipetą matrycę DNA (0,5 ng) dla każdej próbki do odpowiedniej probówki zawierającej mieszaninę do amplifikacji PCR. 7. Do kontroli dodatniej amplifikacji rozcieńczyć 9947A DNA do 1,0 ng w odpowiedniej objętości matrycy DNA. Pobrać pipetą 1,0 ng rozcieńczonego DNA do probówki reakcyjnej zawierającej mieszaninę do amplifikacji PCR. 8. W przypadku kontroli ujemnej amplifikacji do probówki reakcyjnej zawierającej mieszaninę do amplifikacji PCR pobrać pipetą wodę do amplifikacji (zamiast matrycy DNA). 4.B. Termocykle amplifikacji W niniejszej instrukcji podano protokoły stosowania systemu PowerPlex ESX 17 z termocyklerami GeneAmp PCR system 9700 i Urządzenia do amplifikacji i detekcji mogą być różne. W przypadku każdego urządzenia laboratoryjnego może wystąpić konieczność optymalizacji protokołów, w tym liczby cykli i czasu iniekcji. Badania przeprowadzone w firmie Promega wskazują, że dla 0,5 ng oczyszczonej matrycy DNA wystarcza 30 cykli. 1. Umieścić probówki lub płytkę MicroAmp w termocyklerze. 2. Wybrać i uruchomić zalecany protokół Zalecany protokół stosowany w termocyklerach GeneAmp PCR Systems 9700 i 2720 podano poniżej. Protokół cykli termicznych 1 96 C przez 2 minuty, następnie: 94 C przez 30 sekund 59 C przez 2 minuty 72 C przez 90 sekund przez 30 cykli, następnie: 60 C przez 45 minuty 4 C do czasu wyjęcia próbek z termocyklera 1Przy użyciu termocyklera GeneAmp PCR System 9700 program należy wykonywać przy szybkości zmiany (ramp speed) Szybkość zmiany ustawia się po uruchomieniu przebiegu cykli termicznych. Pojawia się ekran Select Method Options (wybór opcji metody). Należy wybrać 9600 jako szybkość zmiany i wpisać objętość reakcji. 3. Po zakończeniu reakcji PCR przechowywać próbki w 20 C i chronić przed światłem. Uwaga: Długotrwałe przechowywanie zamplifikowanych próbek w temperaturze 4 C lub wyższej może prowadzić do powstania produktów degradacji. Strona 8

4 5. Nastawianie aparatury i przygotowywanie próbek 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL Materiały dostarczane przez użytkownika suchy blok grzejny, łaźnia wodna lub termocykler (95 C) pokruszony lód lub łaźnia lodowa wirówka do płytek 96-dołkowych końcówki do pipet odporne na aerozole zestaw kapilar 3500 lub 3500xL, 36cm uchwyt na płytkę 96-dołkową i zestaw podstawowy (standard) (Applied Biosystems nr kat ) polimer POP-4 do analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 lub 3500xL, w woreczku pojemnik z buforem anody pojemnik z buforem katody woreczek z odczynnikiem kondycjonującym do analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 lub 3500xL płytka optyczna 96-dołkowa MicroAmp (lub odpowiednik) i septy formamid Hi-Di (Applied Biosystems nr kat ) wzorce pięciobarwnikowe matrycy PowerPlex 5-Dye Matrix Standards, 3100/3130 (nr kat. DG4700)!! Jakość formamidu ma istotne znaczenie. Należy stosować formamid Hi-Di. Formamid należy zamrażać w porcjach, w temperaturze 20 C. Wielokrotne zamrażanie bądź dłuższe przechowywanie w temperaturze 4 C może doprowadzić do rozkładu formamidu. Formamid niskiej jakości może zawierać jony konkurujące z DNA przy iniekcji, co prowadzi do obniżenia wysokości pików i zmniejszenia czułości. Dłuższy czas iniekcji może nie doprowadzić do wzmocnienia sygnału. Formamid działa drażniąco i teratogennie; należy unikać wdychania i kontaktu tej substancji ze skórą. Należy przeczytać etykietę ostrzegawczą i podczas pracy z niniejszą substancją stosować odpowiednie środki ostrożności. Podczas pracy z formamidem należy zawsze nosić rękawiczki i okulary ochronne. Przygotowanie próbki 1. Przygotować mieszaninę elektroforetyczną przez połączenie i wymieszanie wzorca wewnętrznego CC5 Internal Lane Standard 500 i formamidu Hi-Di w następujący sposób: [(1,0 μl CC5 ILS 500) (liczba iniekcji)] + [(10,0 μl formamidu Hi-Di ) (liczba iniekcji)] Uwaga: Objętość wzorca wewnętrznego ścieżki użytego w mieszaninie elektroforetyczną można podwoić celem dostosowania intensywności pików wzorca wielkości. Objętość formamidu powinna wynosić 10,0 μl; należy dostosować objętość dodawaną do dołków w kroku 3. Strona 9

5 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL (ciąg dalszy) 2. Mieszać w mikrowytrząsarce przez sekund. 3. Za pomocą pipety pobrać 11 μl mieszaniny formamidu i wzorca wewnętrznego ścieżki do każdego z dołków. 4. Dodać 1 μl zamplifikowanej próbki (lub 1 μl mieszaniny drabiny alleli). Dołki przykryć odpowiednią septą. Uwaga: Granice detekcji aparatury są różne, dlatego może wystąpić konieczność zwiększenia bądź zmniejszenia wartości czasu lub iniekcji, jak również ilości produktu wymieszanego z mieszaniną elektroforetyczną. Aby zmodyfikować ustawienia czasu i napięcia nastrzyku, w menu Library (biblioteka) oprogramowania do gromadzenia danych modułu przebiegu należy wybrać opcję Instrument Protocol (protokół aparatury). Jeżeli wysokości pików przekraczają żądane wartości, należy użyć mniejszej ilości matrycy DNA w reakcjach amplifikacji bądź zredukować liczbę cykli programu amplifikacyjnego o 2 4 cykli, aby osiągnąć żądaną intensywność sygnału. 5. Odwirować krótko płytkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dołków. 6. Denaturować próbki przez 3 minuty w temperaturze 95 C, a następnie natychmiast je schłodzić, umieszczając je na pokruszonym lodzie lub na łaźni lodowej na 3 minuty. Próbki zdenaturować bezpośrednio przed załadowaniem do aparatu. Strona 10

6 Przygotowanie aparatury Instrukcje dotyczące harmonogramu konserwacji oraz instalacji zestawu kapilar, woreczków z buforami i polimerami oraz przeprowadzania kalibracji przestrzennej zawiera dokument Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer User Guide. Próbki można analizować zgodnie z opisem zawartym w dokumencie Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer User Guide. 1. Uruchomić program 3500 Data Collection Software. Wyświetli się ekran Dashboard (panel sterowania) (rysunek 2). Upewnić się, że informacje wyświetlane w polach Consumables Information (informacje o materiałach eksploatacyjnych) i Maintenance Notifications (powiadomienia konserwacyjne) są poprawne. Ustawić wartość temperatury pieca na 60 C, a następnie, przynajmniej 30 minut przed rozpoczęciej pierwszej elektroforezy, wybrać opcję Start Pre-Heat (rozpocznij nagrzewanie wstępne), aby rozgrzać piec. Rysunek 2. Ekran Dashboard (panel sterowania). Strona 11

7 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL (ciąg dalszy) 2. Aby utworzyć nowy protokół aparatury (Instrument Protocol), należy przejść do obszaru Library (biblioteka) i wybrać kolejno Instrument Protocol (protokół aparatury) i Create (utwórz). Można również wykorzystać istniejący już protokół aparatury. Rysunek 3 obrazuje ustawienia używane w firmie Promega w przypadku analizatora genetycznego Applied Biosystems 3500xL i w odniesieniu do typu aplikacji, zestawu barwników, długości kapilary, polimeru, modułu przebiegu i właściwych informacji dotyczących protokołu. Jedyną pozycją, dla której nie wybrano ustawienia domyślnego jest ustawienie zestawu barwników.! Podczas tworzenia protokołu aparatury należy pamiętać, aby wybrać ten sam zestaw barwników, którego użyto do przeprowadzenia pięciobarwnikowej kalibracji spektralnej Promega. Zalecamy ustawienie wartości czasu przebiegu wynoszącej 1,210 sekundy oraz domyślnych warunków iniekcji. Czas przebiegu i inne ustawienia aparatu należy zoptymalizować i zweryfikować pod kątem laboratorium użytkownika. Przydzielić protokołowi opisową nazwę. Uwaga: Szczegółowe informacje na ten temat zawiera dokument Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide. 9393TA Rysunek 3. Okno Create New Instrument Protocol (utwórz nowy protokół aparatury). Strona 12

8 3. Aby utworzyć nowy wzorzec wielkości (Size Standard) protokołu QC, należy przejść do obszaru Library (biblioteka). Wybrać Size Standards (wzorce wielkości), a następnie Create (utwórz). Można również wykorzystać istniejący już wzorzec wielkości. Przypisać do wzorca wielkości nazwę PPlex_ILS500 lub inną odpowiednią nazwę. Dla ustawienia Dye Color (kolor barwnika) wybrać opcję Orange (pomarańczowy). Wielkości odcinków wzorca wielkości to 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 i 500 zasad. Patrz rysunek TA Rysunek 4. Okno Create New Size Standard (utwórz nowy wzorzec wielkości). Strona 13

9 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL (ciąg dalszy) 4. Aby utworzyć nowy protokół QC (QC Protocol), należy przejść do obszaru Library (biblioteka). Wybrać QC Protocols (protokoły QC), a następnie Create (utwórz). Można również wykorzystać istniejący już protokół QC. Przydzielić protokołowi opisową nazwę. Wybrać wzorzec wielkości utworzony w kroku 3. Ustawienia protokołu QC powinny opierać się na poddanych wewnętrznej walidacji warunkach pracy systemu PowerPlex ESX 17 na analizatorze genetycznym Applied Biosystems 3500 bądź 3500xL. Rysunek 5 obrazuje jedną z opcji niniejszych ustawień. 9228TA Rysunek 5. Okno Create New QC Protocol (utwórz nowy protokół QC). Strona 14

10 5. Aby utworzyć nowe oznaczenie (Assay), należy przejść do obszaru Library (biblioteka). Wybrać Assays (oznaczenia), a następnie Create (utwórz). Można również wykorzystać oznaczenie, które już istnieje. W oknie Create New Assay (utwórz nowe oznaczenie) (rysunek 6) zaznaczyć protokół aparatury utworzony w kroku 2 oraz protokół QC utworzony w kroku 4. Oznaczeniu nadać opisową nazwę. Wybrać typ aplikacji HID. Oznaczenie jest wymagane w przypadku wszystkich nazwanych próbek na płytce. 9229TA Rysunek 6. Okno Create New Assay (utwórz nowe oznaczenie). Strona 15

11 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL (ciąg dalszy) 6. Aby utworzyć nową konwencję nazwy pliku (File Name Convention) (rysunek 7), należy przejść do obszaru Library (biblioteka). Wybrać File Name Conventions (konwencje nazwy pliku), a następnie Create (utwórz). Można również wykorzystać konwencję nazwy pliku utworzoną wcześniej. Zgodnie z praktyką laboratoryjną w obszarze Select File Name Attributes (wybierz atrybuty nazwy pliku) wybrać atrybuty nazwy pliku i zapisać je pod nazwą opisową. 9252TA Rysunek 7. Okno Create New File Name Convention (utwórz nową konwencję nazwy pliku). Strona 16

12 7. Aby utworzyć grupę wyników (Results Group) (rysunek 8), należy przejść do obszaru Library (biblioteka). Wybrać Results Group (grupa wyników), a następnie Create (utwórz). Można również wykorzystać grupy wyników, które już istnieją. Zgodnie z praktyką laboratoryjną w obszarze Select Results Group Attributes (wybierz atrybuty grupy wyników) wybrać atrybuty grupy wyników i zapisać ją pod nazwą opisową. 8. Aby utworzyć nową płytkę (New Plate), należy przejść do obszaru Library (biblioteka) i z menu Manage (zarządzaj) wybrać Plates (płytki), a następnie Create (utwórz). 9253TA Rysunek 8. Okno Create New Results Group (utwórz nową grupę wyników). Strona 17

13 5.A. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatorów genetycznych Applied Biosystems 3500 i 3500xL (ciąg dalszy) 9. Przydzielić płytce opisową nazwę. Dla typu płytki wybrać z menu rozwijanego opcję HID (rysunek 9). Rysunek 9. Definiowanie właściwości płytki. 10. Wybrać Assign Plate Contents (przypisz zawartość płytki) (rysunek 10). 11. Przypisać dołkom nazwy próbek. 12. W lewej dolnej części ekranu, poniżej pozycji Assays (oznaczenia), wybrać Add from Library (dodaj z biblioteki), aby zaznaczyć oznaczenie utworzone w kroku 5 lub oznaczenie utworzone wcześniej. Kliknąć przycisk Add to Plate (dodaj do płytki) i zamknąć okno. 9255TA 9254TA Rysunek 10. Przypisywanie zawartości płytek. Strona 18

14 13. W obszarze File Name Convention (konwencja nazwy pliku) wybrać opcję Add from Library (dodaj z biblioteki), aby zaznaczyć konwencję nazwy pliku utworzoną w kroku 6 lub konwencję utworzoną wcześniej. Kliknąć przycisk Add to Plate (dodaj do płytki) i zamknąć okno. 14. W obszarze Results Groups (grupy wyników) wybrać opcję Add from Library (dodaj z biblioteki), aby zaznaczyć grupę wyników utworzoną w kroku 7 lub grupę wyników utworzoną wcześniej. Kliknąć przycisk Add to Plate (dodaj do płytki) i zamknąć okno. 15. Zaznaczyć dołki z próbkami, a następnie, w obszarach Assays (oznaczenia), File Name Conventions (konwencje nazwy pliku) i Results Groups (grupy wyników) odpowiadających tym próbkom, zaznaczyć odpowiednie pola. 16. Wybrać Link Plate for Run (powiąż płytkę z przeprowadzaną analizą). 17. Wyświetli się okno Load Plate (załaduj płytkę). Wybrać Yes (tak). 18. W oknie Run Information (informacje o przebiegu) (rysunek 11) przypisać nazwę przebiegu (Run Name). Wybrać Start Run (rozpocznij analizę) (nie podano na rysunku). 9256TA Rysunek 11. Przypisywanie nazwy przeprowadzanej analizie. Strona 19

15 5.B. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatora genetycznego ABI PRISM 3100 lub 3100-Avant z oprogramowaniem Data Collection, wersja 2.0 i analizatora genetycznego Applied Biosystems 3130 lub 3130xl z oprogramowaniem Data Collection, wersja 3.0 Materiały dostarczane przez użytkownika suchy blok grzejny, łaźnia wodna lub termocykler (95 C) pokruszony lód lub łaźnia lodowa wirówka do płytek 96-dołkowych końcówki do pipet odporne na aerozole zestaw kapilar 3100 lub 3130, 36 cm polimer o zoptymalizowanej wydajności 4 (POP-4 ) do 3100 lub 3130 bufor do analizatora genetycznego 10X z EDTA płytka optyczna 96-dołkowa MicroAmp i septy formamid Hi-Di (Applied Biosystems nr kat ) wzorce pięciobarwnikowe matrycy PowerPlex 5-Dye Matrix Standards, 3100/3130 (nr kat. DG4700)!! Jakość formamidu ma podstawowe znaczenie. Należy stosować formamid Hi-Di. Formamid zamrażać w porcjach, w 20 C. Wielokrotne rozmrażanie lub dłuższe przechowywanie w 4 C może doprowadzić do rozkładu formamidu. Formamid nieodpowiedniej jakości może zawierać jony konkurujące z DNA przy iniekcji, co prowadzi do obniżenia wysokości pików i zmniejszenia czułości. Dłuższy czas iniekcji może nie doprowadzić do wzmocnienia sygnału. Formamid działa drażniąco i kancerogennie - należy unikać wdychania i kontaktu tej substancji ze skórą. Należy przeczytać etykietę ostrzegawczą i przy pracy z formamidem zachowywać odpowiednie środki ostrożności. Przy pracy z formamidem zawsze nosić rękawiczki i okulary ochronne. Przygotowanie próbki 1. Przygotować mieszaninę obciążającą przez połączenie i wymieszanie wzorca wewnętrznego CC5 Internal Lane Standard 500 i formamidu Hi-Di w sposób następujący: [(1,0 µl CC5 ILS 500) (liczba iniekcji)] + [(10,0 µl formamidu Hi-Di ) (liczba iniekcji)] Uwaga: Objętość wzorca wewnętrznego ścieżki użytego w mieszaninie obciążającej można podwoić celem dostosowania intensywności pików wzorca wielkości. Objętość formamidu powinna wynosić 10,0 µl; należy odpowiednio dostosować objętość dodawaną do dołków w kroku Mieszać na mikrowytrząsarce przez sekund. 3. Pobrać pipetą 11 µl mieszaniny formamidu i wzorca wewnętrznego ścieżki do każdego dołka. 4. Dodać 1 µl zamplifikowanej próbki (lub 1 µl mieszaniny drabiny alleli PowerPlex ESX 17). Dołki przykryć odpowiednią septą. Strona 20

16 Uwaga: Granice detekcji aparatury są różne, dlatego może wystąpić konieczność dostosowania czasu bądź napięcia iniekcji, jak również ilości produktu wymieszanego z mieszaniną obciążającą. Aby zmodyfikować ustawienia czasu i napięcia iniekcji w module przebiegu, należy użyć narzędzia Module Manager (menedżer modułów) oprogramowania do gromadzenia danych (patrz część Przygotowanie aparatury poniżej). 5. W razie potrzeby krótko odwirować płytkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dołków. 6. Denaturować próbki przez 3 minuty w 95 C, a następnie natychmiast schłodzić je na pokruszonym lodzie lub na łaźni lodowej przez 3 minuty. Próbki zdenaturować bezpośrednio przed załadowaniem do aparatu. Przygotowanie aparatury Instrukcje czyszczenia, instalacji zestawu kapilar, przeprowadzania kalibracji przestrzennej i dodawania polimeru znajdują się w instrukcji użytkowania aparatury. Przeprowadzić analizę próbek tak, jak opisano w instrukcji użytkowania analizatora genetycznego ABI PRISM 3100 lub 3100-Avant z oprogramowaniem Data Collection, wersja 2.0 i analizatora genetycznego Applied Biosystems 3130 lub 3130xl z oprogramowaniem Data Collection, wersja 3.0, z następującymi wyjątkami. 1. W Module Manager wybrać New (nowy). Wybrać Regular (normalny) z listy rozwijanej Type (typ) i wybrać HIDFragmentAnalysis36_POP4 z listy rozwijanej Template (matryca). Sprawdzić, czy czas iniekcji wynosi 5 sekund, napięcie iniekcji 3 kv i czas trwania elektroforezy 1500 sekund. Wpisać nazwę opisową modułu przebiegu elektroforezy i wybrać OK. Uwaga: Czułość aparatury może być różna. Czas iniekcji i napięcia można regulować w Module Manager. Zalecany zakres czasu iniekcji wynosi 3-22 sekund, zaś napięcia iniekcji 1-3 kv. 2. W Protocol Manager (menedżer protokołów) wybrać New (nowy). Wpisać nazwę protokołu. Wybrać Regular (normalny) z listy rozwijanej Type (typ) i wybrać moduł przebiegu utworzony w poprzednim kroku z listy rozwijanej Run Module (moduł przebiegu). Na koniec z listy rozwijanej zestawu barwników wybrać G5. Wybrać OK. 3. W Plate Manager (menedżer płytek) utworzyć nową kartę płytki, zgodnie z instrukcją obsługi aparatury. W oknie dialogowym wybrać GeneMapper Generic z listy rozwijanej Application (zastosowanie) i wybrać odpowiedni typ płytki (96-dołkowa). Wprowadzić dane do okien właściciela i operatora i wybrać OK. Uwaga: Jeśli należy przeprowadzić automatyczną analizę danych próbki, postępować zgodnie z instrukcją obsługi aparatury. 4. W karcie płytki programu GeneMapper wpisać nazwy próbek w odpowiednich komórkach. Przewinąć w prawo. W kolumnie Results group 1 (grupa wyników) wybrać żądaną grupę wyników. W kolumnie Strona 21

17 5.B. Detekcja fragmentów zamplifikowanych przy użyciu analizatora genetycznego ABI PRISM 3100 lub 3100-Avant z oprogramowaniem Data Collection, wersja 2.0 i analizatora genetycznego Applied Biosystems 3130 lub 3130xl z oprogramowaniem Data Collection, wersja 3.0 (ciąg dalszy) 4. W karcie płytki programu GeneMapper wpisać nazwy próbek w odpowiednich komórkach. Przewinąć w prawo. W kolumnie Results group 1 (grupa wyników) wybrać żądaną grupę wyników. W kolumnie Instrument Protocol 1 (protokół aparatury) wybrać protokół utworzony w kroku 2. Sprawdzić, czy znajduje się on w każdym wierszu zawierającym nazwę próbki. Wybrać OK. Uwaga: Aby utworzyć nową grupę wyników, wybrać New z menu rozwijanego w kolumnie grupy wyników. Wybrać zakładkę General (ogólne) i wpisać nazwę. Wybrać zakładkę Analysis (analiza) i z listy rozwijanej typu analizy wybrać GeneMapper Generic. 5. Włożyć próbki do urządzenia i zamknąć drzwiczki. 6. W podglądzie widma (Spectral Viewer) wybrać zestaw barwników G5 i potwierdzić, że aktywnym zestawem barwników jest plik utworzony dla analizy elektroforetycznej 5-barwnikowego zestawu PowerPlex.! Wybór właściwego zestawu G5 do analizy elektroforetycznej 5-barwnikowego zestawu PowerPlex ma zasadnicze znaczenie. Jeśli zestaw do analizy 5-barwnikowej PowerPlex nie jest aktywnym zestawem barwników, znaleźć dane spektralne zestawu do analizy 5-barwnikowej PowerPlex w List of Calibrations for Dye Set G5 (lista kalibracji dla zestawu barwników G5) i wybrać Set (wybierz). 7. W programie planującym przebieg znaleźć kartę płytki (sample sheet) utworzoną w krokach 3 i 4 i kliknąć nazwę, aby ją podświetlić. 8. Po podświetleniu karty płytki kliknąć obraz płytki odpowiadający płytce w autosamplerze zawierającej zamplifikowane próbki. 9. Po powiązaniu karty płytki z płytką obraz płytki zmieni się z żółtego na zielony i stanie się dostępna zielona strzałka Run Instrument (rozpocznij pracę). 10. Kliknąć na zieloną strzałkę Run Instrument na pasku narzędzi, aby rozpocząć przebieg dla próbek. 11. Monitorować elektroforezę obserwując okno przebiegu, widoku, zestawu lub przeglądarki kapilar w oprogramowaniu do gromadzenia danych. Każda analiza trwa około 40 minut. Strona 22

18 5.C. Detekcja zamplifikowanych fragmentów za pomocą analizatora genetycznego ABI PRISM 310!! Materiały dostarczane przez użytkownika suchy blok grzejny, łaźnia wodna lub termocykler (95 C) pokruszony lód lub łaźnia lodowa kapilary 310, 47cm 50µm polimer o zoptymalizowanej wydajności 4 (POP-4 ) bufor do analizatora genetycznego 10X z EDTA probówki na próbki i septy końcówki do pipet odporne na aerozole formamid Hi-Di (Applied Biosystems nr kat ) wzorce pięciobarwnikowe matrycy PowerPlex 5-Dye Matrix Standards, 310 (nr kat. DG4600) Jakość formamidu ma podstawowe znaczenie. Należy stosować formamid Hi- Di. Formamid zamrażać w porcjach w 20 C. Wielokrotne rozmrażanie lub dłuższe przechowywanie w 4 C może doprowadzić do rozkładu formamidu. Formamid nieodpowiedniej jakości może zawierać jony konkurujące z DNA przy iniekcji, co prowadzi do obniżenia wysokości pików i zmniejszenia czułości. Dłuższy czas iniekcji może nie doprowadzić do wzmocnienia sygnału. Formamid działa drażniąco i kancerogennie - należy unikać wdychania i kontaktu tej substancji ze skórą. Należy przeczytać etykietę ostrzegawczą i przy pracy z formamidem zachowywać odpowiednie środki ostrożności. Przy pracy z formamidem zawsze nosić rękawice i okulary ochronne. Przygotowanie próbki 1. Przygotować mieszaninę elektroforetyczną przez połączenie i wymieszanie wzorca wewnętrznego CC5 Internal Lane Standard 500 i formamidu Hi-Di w sposób następujący: [(1,0 µl CC5 ILS 500) (liczba iniekcji)] + [(24,0 µl formamidu Hi-Di ) (liczba iniekcji)] Uwaga: Objętość wewnętrznego wzorca wielkości (ILS) użytego w mieszaninie elektroforetycznej można podwoić celem dostosowania intensywności pików wzorca wielkości. W przypadku wystąpienia zbyt wysokich pików zalecamy zmianę mieszaniny obciążającej do postaci zawierającej 0,5 µl wzorca CC5 ILS 500 i 24,5 µl formamidu Hi-Di. 2. Wymieszać na mikrowytrząsarce przez sekund. 3. Połączyć 25,0 µl przygotowanej mieszaniny obciążającej i 1,0 µl zamplifikowanej próbki (lub 1 µl mieszaniny drabiny alleli PowerPlex ESX 17). Uwaga: Granice detekcji aparatury są różne, dlatego może wystąpić konieczność zwiększenia bądź zmniejszenia wartości czasu lub napięcia iniekcji, jak również ilości produktu wymieszanego z mieszaniną elektroforetyczną. Aby zmodyfikować ustawienia czasu i napięcia iniekcji w module przebiegu, należy użyć narzędzia Module Manager (menedżer modułów) oprogramowania Data Collection (patrz część Przygotowanie aparatury poniżej). 4. W razie potrzeby krótko odwirować probówki, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dołków. Strona 23

19 5.C. Detekcja zamplifikowanych fragmentów za pomocą analizatora genetycznego ABI PRISM 310 (ciąg dalszy) 5. Zdenaturować próbki w 95 C przez 3 minuty, a następnie natychmiast schłodzić na pokruszonym lodzie lub na łaźni lodowej przez 3 minuty. Próbki zdenaturować bezpośrednio przed załadowaniem. 6. Ustawić próbki na odpowiedniej półce autosamplera. 7. Włożyć półkę autosamplera do urządzenia i zamknąć drzwiczki. Przygotowanie aparatury Instrukcje czyszczenia bloku pompy, instalacji kapilary, kalibracji autosamplera i dodawania polimeru do strzykawki znajdują się w instrukcji użytkowania aparatury. 1. Otworzyć program do gromadzenia danych ABI PRISM Przygotować arkusz próbki GeneScan zgodnie z Instrukcją użytkowania analizatora genetycznego ABI PRISM 310. Wpisać odpowiednie informacje o próbce do kolumny Sample Info. Dla rzędów zawierających mieszaninę drabiny alleli PowerPlex ESX 17 wpisać słowo ladder (drabina) do kolumny Sample info dla barwników: fluoresceiny, JOE, TMR-ET, CXR-ET i CC5. Wpisanie tych informacji jest konieczne, aby analiza danych za pomocą makra PowerTyper ESX 17 przebiegła pomyślnie. 3. Utworzyć nową listę iniekcji GeneScan. Wybrać odpowiednią kartę próbki z menu rozwijanego. 4. Wybrać moduł GS STR POP4 (1 ml) G5 z menu rozwijanego. Zmienić czas iniekcji na 3 sekundy, a czas przebiegu na 28 minut. Ustawienia pozostałych parametrów powinny być następujące: Inj. Secs: 3 Inj. kv: 15,0 Run kv: 15,0 Run C: 60 Run Time: 28 Dla innej aparatury może być konieczna optymalizacja czasu iniekcji.! Dla próbek zawierających 0,5 ng matrycy DNA zaleca się czasy iniekcji 2-5 sekund. Uwaga: W czasie długiego przebiegu pracy analizatora genetycznego ABI PRISM 310 migracja fragmentów może się nieco zmieniać. Może to wynikać ze zmian temperatury lub innych parametrów. Przy analizie wielu próbek iniekcje drabiny alleli w różnych momentach przebiegu mogą ułatwić dokładne genotypowanie próbek. 5. Wybrać odpowiedni plik matrycy. 6. W celu automatycznej analizy danych zaznaczyć pole wyboru auto analyze i wybrać odpowiednie parametry analizy i wzorzec wielkości. Dokładne informacje o tych opcjach znajdują się w Instrukcji użytkowania analizatora genetycznego ABI PRISM Po włożeniu półki z próbkami i zamknięciu drzwiczek wybrać Run (uruchom), aby rozpocząć elektroforezę kapilarną. Strona 24

20 8. Monitorować elektroforezę obserwując okna danych pierwotnych i statusu. Dla każdej próbki pompowanie strzykawką, pobranie próbek i elektroforeza próbek trwa około 35 minut. 6. Analiza danych 6.A. Panel i zestawy plików bin i pików pobocznych (stutter peaks) systemu PowerPlex ESX z oprogramowaniem GeneMapper ID-X, wersja 1.2 Aby ułatwić analizę danych wygenerowanych przez system PowerPlex ESX 17, utworzyliśmy panel i pliki bin umożliwiające automatyczne przypisywanie genotypów za pomocą oprogramowania GeneMapper ID-X. Zalecamy, aby użytkownicy oprogramowania GeneMapper ID-X zainstalowanego na analizatorach Applied Biosystems zapoznali się z prawidłową obsługą niniejszego oprogramowania. Uwaga: Wymienione zestawy plików i panel są zgodne z wcześniejszymi wersjami oprogramowania GeneMapper ID-X. Rozpoczęcie pracy 1. Odpowiedni panel, pliki bin i stutter systemu PowerPlex ESX 17 znajdują się na stronie: 2. Wpisać informacje kontaktowe, a następnie wybrać GeneMapper ID-X. Wybrać Submit (akceptuj). 3. Zapisać pliki PowerPlex_ESX_Panels_IDX_vX.x.txt, PowerPlex_ESX_Bins_IDX_vX.x.txt oraz PowerPlex_ESX_Stutter_IDX_vX.x.txt ( X.x oznacza najnowszą wersję pliku panelu i plików bin) w znanym miejscu na komputerze użytkownika. Importowanie plików Panel, Bin i Stutter 1. Otworzyć program GeneMapper ID-X. 2. Wybrać Tools (narzędzia), a następnie Panel Manager (menedżer panelu). 3. Zaznaczyć ikonę Panel Manager na lewym górnym panelu nawigacyjnym. 4. Wybrać File (plik), a następnie Import Panels (importuj panele). 5. Przejść do pliku panelu pobranego w punkcie Rozpoczęcie pracy. Zaznaczyć plik, a następnie wybrać Import (importuj). 6. Na panelu nawigacyjnym zaznaczyć folder PowerPlex ESX, importowany w kroku Wybrać File (plik), a następnie Import Bin Set (importuj zestaw plików bin). 8. Przejść do pliku bin pobranego w punkcie Rozpoczęcie pracy. Zaznaczyć plik, a następnie wybrać Import (importuj). 9. Na panelu nawigacyjnym zaznaczyć folder paneli PowerPlex ESX, importowany w kroku 5. Strona 25