Domowy spektrofotometr z telefonu komórkowego i programu ImageJ

Transkrypt

1 Domowy spektrofotometr z telefonu komórkowego i programu ImageJ Spektrofotometr to urządzenie pomiarowe, dzięki któremu można ustalić ilość światła pochłanianą lub rozpraszaną przez próbkę. Urządzenie to stanowi jedno z ważniejszych elementów wyposażenia współczesnego laboratorium biochemicznego. Pomiar aktywności enzymatycznej prędzej czy później zwykle sprowadza się do jakiejś reakcji barwnej, która wskazuje na ilość substratu lub produktu. Porównując różnice w pochłoniętej lub rozproszonej ilości światła można wywnioskować ilość substratu, która ubyła w wyniku zajścia reakcji enzymatycznej lub ustalić ilość produktu, który powstał dzięki reakcji. Jest to więc narzędzie, które pozwala na otrzymanie ilościowych wyników, które pozwalają również na wnioskowanie statystyczne i określenie czy zaobserwowane różnice w wariantach doświadczenia jest różnicą wiarygodną czy należy uznać je za przypadek. Problemem spektrofotometru jest jednak cena; jest to wydatek co najmniej kilku tysięcy złotych, co powoduje, że raczej nie jest urządzeniem powszechnie spotykanym w szkolnych pracowniach. Jednak dzięki powszechnemu dostępowi do cyfrowych aparatów fotograficznych i darmowemu programowi komputerowemu problem ten można spróbować rozwiązać. Na przykład, chcąc ocenić ilość strawionego białka w roztworze odtłuszczonego mleka wystarczy wykonać zdjęcie zestawu probówek zawierających badany preparat. Oczywiście wykonując to zdjęcie należy zwrócić uwagę na to, czy światło pada na nie równomiernie i czy rzeczywiście dolna część probówki zawierająca badane roztwory znajduje się na czarnym, jednolitym tle. Takie zdjęcie należy przesłać na komputer i poddać analizie według następujących wskazówek: 1. Należy pobrać program ImageJ ze strony: i zainstalować na komputerze. 2. Otworzyć to zdjęcie w programie ImageJ (File -> Open). Często popełnianym błędem jest otwieranie zdjęć w systemie operacyjnym, w trybie pozwalającym jedynie na jego przeglądanie. Konieczne jest kliknięcie na pasek, który pojawia się przy uruchomieniu program ImageJ i wczytanie analizowanego zdjęcia do programu. 3. Zaznaczyć oś, wzdłuż której będzie wykonywany pomiar, korzystając z odpowiedniego przycisku na pasku narzędzi. 4. Wybranie opcji (Analyze -> Plot Profile) umożliwi wyświetlenie wykresu, dzięki któremu można odczytać stopień "zmętnienia" w poszczególnych probówkach. 5. W wyniku analizy zdjęcia umieszczonego niżej, otrzymuje się wykres, z którego można odczytać

2 ilościowe dane dotyczące stopnia zabielenia poszczególnych próbek. Mając na jednym zdjęciu próbę kontrolną i próby badane można określić np. procentowy ubytek substratu po reakcji enzymatycznej trwającej przez określony czas. To tylko jedna z naprawdę wielu możliwości zastosowania programu ImageJ. Kompletnym źródłem informacji o programie ImageJ jest instrukcja udostępniona przez instytucję, która stworzyła ImageJ, czyli amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia: jednak może się okazać, że jest ono zbyt obszerne dla zwykłego użytkownika. Dobrym pomysłem jest przeszukać bazę filmów umieszczonych w serwisie YouTube hasłem ImageJ tutorial. Z pewnością zostanie wyświetlona długa lista filmów pokazujących możliwości programu ImageJ. Dodatkowa literatura ETP002901%20Diagnostyka%20obrazowa/ Obliczenia statystyczne w naukach biologicznych Naukowe wnioskowanie wymaga wiarygodnych danych. Czytelnik publikacji czy odbiorca wyników doświadczeń musi wiedzieć, czy zaprezentowane dane są dziełem przypadku czy są wiarygodne. Z drugiej strony, będąc badaczem, który wykonał doświadczenia, opisał je i chciałby przekonać słuchaczy lub czytelników do swoich racji, dobrze jest od razu uzbroić się w informacje, które pomogą przekonać nieprzekonanych. W osiągnięciu tego celu pomocne są powtórzenia prób i metody statystyczne. Wyniki raz przeprowadzonego doświadczenia mogą być dziełem przypadku. Tak jak rzut kostką i wylosowana liczba jest dziełem przypadku. Co innego, jeśli tą samą kostką rzuci się sześćset razy. Można się spodziewać, z drobnymi odchyleniami, że każda liczba wypadła ok. sto razy. Wykonując doświadczenia, warto każdą próbę powtórzyć co najmniej kilka razy. Dotyczy to zarówno prób badanych, jak i prób kontrolnych. Oczywiście im więcej powtórzeń, tym lepiej, choć gdzieś trzeba postawić sobie granicę. Przy pewnej liczbie powtórzeń wprost

3 wykonanie takiego doświadczenia stałoby się zbyt trudne organizacyjnie. Warto też zwrócić uwagę, że pod słowem powtórzenie mogą się kryć dwa pojęcia. Pierwsze z nich dotyczy wykonania kilku takich samych prób w ramach jednego doświadczenia. Drugie zaś odnosi się do rzeczywiście niezależnych doświadczeń, do których należy np. przygotować odczynniki od początku. Nie ma jasnych wytycznych jak należy postępować, ale z pewnością powtarzający się wynik czy pomiar przy prawdziwie niezależnych doświadczeniach może dostarczyć mocnych argumentów, które pozwolą przekonać niemal każdego odbiorcę do wniosków wynikających z takich doświadczeń. Jeśli dysponujemy pulą danych wynikających z przeprowadzonych doświadczeń, z danych tego samego typu należy obliczyć średnią arytmetyczną. W tym miejscu zasadne wydaje się odwołanie się do konkretnego przykładu w celu podkreślenia mankamentów posługiwania się średnią jako jedyną miarą w opracowywaniu wyników wielu doświadczeń. 1. Przeprowadzono klasówki w klasach A i B. W klasie jest 10 uczniów, ponieważ jest to szkoła w małej miejscowości. Wyniki poszczególnych uczniów są podzielone średnikami. Klasa A 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4; 4 Ile wynosi średnia? Klasa B 5; 5; 5; 5; 5; 4; 4; 3; 2; 2 Ile wynosi średnia? 2. W której klasie oceny poszczególnych uczniów są bardziej zróżnicowane? 3. Jak zmierzyć to zróżnicowanie? Do tego służy miara, którą określa się odchyleniem standardowym. Żeby ją obliczyć, najpierw trzeba obliczyć wariancję w następujący sposób: (i) od liczby punktów każdego ucznia odejmij średnią (ii) każdą z tych liczb [wyniku z (i)] podnieś do kwadratu (iii) dodaj je i podziel przez liczbę uczniów (iv) to będzie wariancja W klasie A będzie to wyglądać tak: (i) 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; 4-4; (ii) 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 ; 0 2 (iii) 0/10 (iv) 0 W klasie B będzie to wyglądać tak: (i) 5-4; 5-4; 5-4; 5-4; 5-4; 4-4; 4-4; 3-4; 2-4; 2-4 (ii) 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 1 2 ; 0 2 ; 0 2 ; (-1) 2 ; (-2) 2 ; (-2) 2, czyli 1; 1; 1; 1; 1; 0; 0; 1; 4; 4 (iii) 14/10 (iv) 1,4

4 4. Wreszcie można obliczyć odchylenie standardowe, które jest po prostu pierwiastkiem wariancji, czyli: w klasie A 0 = 0 a w klasie B 1,4 = 1,183 Porównując wartości odchylenia standardowego z obu klas (0 versus 1,183) można określić jak bardzo nierówne były wyniki sprawdzianu uzyskane w obu klasach, mimo tej samej średniej. Jednak nie należy na tym kończyć analizy wyników z rozmaitych doświadczeń. Warto jeszcze iść o krok dalej i sprawdzić, czy różnice zaobserwowane między grupami (w wyżej wymienionym przykładzie będą to oczywiście dane pochodzące z klasówek przeprowadzonych w klasach A i B), nie są dziełem przypadku. W analizie niezależnych od siebie grup danych często stosuje się test t Studenta 1. Obliczanie statystyki jest jednak dość skomplikowane, dlatego warto skorzystać z odpowiedniego oprogramowania. Może to być arkusz kalkulacyjny (m.in. Microsoft Excel), jednak w środowisku naukowym znaczną popularnością cieszy się darmowy program R. Korzystając z niego można także bardzo łatwo obliczyć wartości odchylenia standardowego. 1. Przeprowadzono pomiar masy kurzych jaj z chowu klatkowego i z wolnego wybiegu. Wyniki poszczególnych uczniów są podzielone średnikami. Chów klatkowy 51; 49; 50; 53; 48; 49 Z wolnego wybiegu 49; 51; 53; Sprawdźmy, czy sposób hodowli kur istotnie wpływa na masę jaj korzystając z metod statystycznych. 3. Należy pobrać program R ze strony: i zainstalować na komputerze. 4. Pierwszy krok w korzystaniu programu R to wprowadzenie danych następującymi komendami: KL <- c(51, 49, 50, 53, 48, 49) 1 Zanim rozpocznie się analizę testem t Studenta, powinno się sprawdzić normalność rozkładu testem Kolmogorowa-Smirnowa. Jednak dla uproszczenia niniejszego opisu etap ten został pominięty, zakładając, że dane użyte w przykładzie mają rozkład normalny.

5 Klawiszem enter należy potwierdzić wpisaną treść. Następnie należy wprowadzić kolejną grupę danych: WW <- c(49, 51, 53, 50) KL (chów klatkowy) i WW (wolny wybieg) to nazwy zbiorów, w których będą przechowywane dane. Nazwy te mogą być dowolne, ale nie mogą zawierać odstępów. 5. Można sprawdzić wprowadzone dane w następujący sposób: print (KL) W tym przypadku także wpisaną treść należy potwierdzić klawiszem enter. Powinien pojawić się wiersz zawierający następujące dane: Odchylenie standardowe można obliczyć komendą: sd (KL) Po naciśnięciu klawisza enter pojawi się obliczona wartość: W przypadku jaj z wolnego wybiegu będzie to wyglądało w następujący sposób: sd (WW) Obliczenie statystyki testu t Studenta jest równie proste. Należy wpisać komendę: t.test (KL, WW) i nacisnąć klawisz enter. Pojawi się następujący komunikat. Welch Two Sample t-test data: KL and WW t = , df = 6.808, p-value = alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0 95 percent confidence interval:

6 sample estimates: mean of x mean of y Można dowiedzieć się, że średnia zbiorów KL i WW wynosi, odpowiednio, 50,00 i 50,75, zaś to, co najistotniejsze znajduje się za hasłem p-value, czyli wartość 0,5264. Jest ona znacznie większa niż najczęściej uznawana za progową w naukach przyrodniczych wartość 0,05 (5%). Jest to przesłanka, że należy przyjąć tzw. hipotezę zerową (H0), która mówi zawsze o tym, że nie ma różnic między badanymi grupami. Można zatem uznać, że sposób hodowli kur nie wpływa na masę znoszonych przez nie jaj. Gdyby wartość p była mniejsza niż 0,05, wówczas należałoby odrzucić H0 i uznać, że sposób hodowli kur ma wpływ na masę jaj.