Mitochondrialny DNA jako źródło markerów molekularnych

Transkrypt

1 Mitochondrialny DNA jako źródło markerów molekularnych

2 Po co nam mitochondrialny DNA? bp Różnica w zawartości G nić ciężka (H) i lekka (L) 37 genów 22 trna, 12S i 16S rrna, 13 genów kodujących białka (składniki kompleksów łańcucha oddechowego) Wysoce upakowana organizacja nie ma intronów, sekwencje kodujące są ułożone jedna za drugą lub oddzielone jedynie kilkoma nukleotydami Dwa obszary niekodujące pętla D 1 kpz (początek replikacji nici H, promotory transkrypcji dla nici L i H) - region 30 pz początek replikacji nici L W pętli D znajdują się dwa regiony polimorficzne Hypervariable Region I (HVI) i Hypervariable Region II (HVII) o długości 342 pz i 268 pz

3 Mateczne dziedziczenie mtdna Mikroiniekcja plemników do oocytów i ich późniejszy rozwój Plemnik przed i po (60 min) mikroinjekcji Mechanizmy: 1. Rozcieńczenie ojcowskiego mtdna plemnik 100 kopii oocyt Aktywna eliminacja mtdna plemnika towarzysząca zapłodnieniu: (i) Stopniowe zmniejszenie liczby mt nukleoidów podczas spermatogenezy (ii) Degradacja mtdna plemnika po zapłodnieniu, ale przed destrukcją mitochondriów plemnika Podwójne barwienie: DNA SYBR Green I Mitochondria- MitoTracker CMTMRos Ryżówka japońska

4 Cechy mtdna heteroplazmia - komórka zawiera setki mitochondriów, a każde z nich 2-10 cząsteczek mtdna - genom mitochondrialny ewoluuje dużo szybciej niż jądrowy, liczba różnic między dwoma ludzkimi genomami mitochondrialnymi od 10 do 66 - heteroplazmia - Mutacje mtdna u ludzi mogą powodować ubytek energii w komórce, który wpływa najbardziej na: - ośrodkowy układ nerwowy - mięsień sercowy - mięśnie szkieletowe - nerki - tkanki produkujące hormony - ale nie płuca lub wątroba! CTCTCCCACTTTAAAGCTAAATAAGGA? G

5 Polimorfizm ludzkiego mtdna Morf wzór restrykcyjny otrzymywany za pomocą danego enzymu restrykcyjnego Morfy AvaII Haplogrupa typy mtdna charakteryzujące się obecnością lub brakiem miejsc restrykcyjnych dla jednego lub kilku enzymów restrykcyjnych. Do pewnego stopnia odzwierciedlają ewolucję ludzkiego mtdna.

6 W obrębie haplogrupy występują różne haplotypy

7

8 Ćwiczenia kto należy do haplogrupy H? Haplogrupa H barak miejsca cięcia dla enzymu AluI w pozycji 7025 bp. 1. Amplifikacja fragmentu mtdna o wielkości 264 bp, który zawiera region polimorficzny. 2. Trawienie enzymem AluI i elektroforeza w żelu agarozowym. Produkty PCR produkty PCR/AluI -H H H -H 264 bp , 40

9 Markery mtdna mutacje punktowe, rzadziej delecje, służące diagnozowaniu chorób mitochondrialnych.

10 Choroby związane z mutacjami w mtdna to choroby neurodegeneracyjne - mutacje punktowe w - genach trna MERRF padaczka, poszarpane czerwone włókna (ang. myoclonic epilepsy and ragged red fibre) MELAS mitochondrialna encefalomiopatia, kwasica mleczanowa, napady udaropodobne (ang. mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes) - genach rrna AID 12SRNA - głuchota spowodowana przez aminoglikozydy (antybiotyki: spektromycyna, kanamycyna, neomycyna, gentamycyna) (ang. aminoglycoside-induced deafness) - genach kodujących białka LHON dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera (ang. Leber s hereditary optic neuropathy) NARP neuropatia obwodowa mięśni, ataksja i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (ang. neurogenic muscle weakness, ataxia and retinitis pigmentosa) Zespół Leigha (ang. Leigh syndrome) mutacje w białkach kompleksu I, zaburzenia motoryczne, niewydolność mięśni oddechowych opóźnienie rozwoju

11

12 delecje pomiędzy COXI a cyt b (1 8 kpz), dwie częste delecje (4997 pz i 7436 pz), zazwyczaj są sporadyczne rzadko dziedziczne CPEO przewlekły postępujący paraliż mięśni oka (ang. chronic progressive external ophtalmoplegia) Zespół Kearnsa-Sayre a (KSS) (ang. Kearns-Sayre syndrome) degeneracja siatkówki, zaburzenia pracy serca, niski wzrost, utrata słuchu, cukrzyca, niewydolność nerek Zespół Pearsona (ang. Pearson s syndrome) zaburzenia w produkcji czerwonych krwinek, upośledzone działanie trzustki

13

14 Objawy kliniczne chorób mitochondrialnych Miopatie Encefalopatie Kardiomiopatie Oftalmoplegia (porażenie mięśni odwodzących oka) Zmęczenie Ataksja (brak koordynacji ruchów) Padaczka Udar Uszkodzenia nerwu wzrokowego Głuchota Demencja Bóle głowy Dystonia

15 Mutacje mtdna i nowotwory

16

17 THIS SITE BEST VIEWED IN INTERNET EXPLORER 4.5 AND NETSCAPE 5.0 OR NEWER VERSIONS! Forensic Mitochondrial DNA Analysis When forensic cases arise where there is insufficient biological material for nuclear DNA typing, mitochondrial DNA analysis can provide valuable supplemental information, even from such limited samples as half-centimeter long hair fragments or single teeth. Because of its usefulness when limited biological material is available, and due to its unique pattern of maternal inheritance, mtdna is playing a significant role in investigation and prosecution of active criminal cases, post-conviction exoneration, re-examination of cold cases, genealogical studies where maternal relatedness is in question, and missing persons investigations.

18 Forensic Use of Mitochondrial DNA The Defense Department certified the use of mitochondrial DNA as a forensic tool in identifiying long-dead or unknown servicemen. Blood samples have been collected from more than 1,800 family members of servicemen who remain missing action. Mitochondrial DNA is passed down through the maternal line and can be nearly identical within the same family for up to 30 generations. Shown below is a hypothetical pedigree indicating some of the relatives of a serviceman who could be used for identification.

19 Znaczenie mtdna w identyfikacji materiału biologicznego Kiedy wykorzystuje się analizę mtdna w testach na potwierdzenie tożsamości: - zdegradowany materiał biologiczny - bardzo małe ilości materiału wyjściowego do badań Przypadki, w których analiza mtdna jest szczególnie przydatna Identyfikacja osób zaginionych jeśli dostępny jest materiał genetyczny od ich matki - dziedziczenie mateczne mtdna Jeśli materiałem dowodowym są włosy lub zdegradowane (nawet spalone) szczątki szkieletu - włosy od fragmentów o długości 3 mm - średnica włosa - odległość od cebulki Sprawy rozpatrywane ponownie po długim czasie od wydania pierwszego wyroku Ograniczenia - analiza mtdna nie pozwala na rozróżnienie osób spokrewnionych w linii matki (matka i córka, brat i siostra)

20

21 Analiza mtdna z trudnych źródeł Mitotyping Technologies, State College, Pennsylvania, USA Indywidualna analiza każdej próbki Kompletna sekwencja regionów HV1 ( ) i HV2 (30 407) Pierwsze podejście amplifikacja fragmentów o długości ok. 250 pz Drugie podejście (ang. ancient DNA approach) amplifikacja mniejszych fragmentów pz z HV1 (metoda stosowana z sukcesem w analizie szczątków szkieletowych Neandertalczyków). Trudność większe zagrożenie zanieczyszczeniem! Trudności w analizie mtdna wynikające z obecności heteroplazmii Różnorodność typów mtdna prawdopodobieństwo przypadkowego wybrania dwóch identycznych prób jest jak 1:300 1:400.

22 Identyfikacja szczątków rodziny Romanowów cd. Tożsamość Aleksandry potwierdzono wykazując identyczność mtdna w odnalezionych szczątkach i mtdna księcia Edynburga Filipa Tożsamość cara Mikołaja analiza mtdna dwojga krewnych w linii matecznej

23 Snuppy to prawdziwy klon otrzymany metodą transferu jądra komórki somatycznej Tai Snuppy ncdna = ncdna mtdna = mtdna

24

25 WYNIKI Badania objęły populacje plemienne oraz kastowe Brak istotnej różnicy w mtdna pomiędzy populacjami plemiennymi a kastami, jedynie w wyższych kastach większa częstotliwość haplogrup Euroazjatyckich. Różna dystrybucja markerów chromosomu Y w populacjach plemiennych i kastach. Większe podobieństwo populacji plemiennych do niższych niż do wyższych kast. WNIOSKI Jednorodność matczynej puli genowej wskazuje na to, że od późnego Plejstocenu inwazje Indii były dokonywane przez mężczyzn. Niższe kasty wywodzą się z populacji plemiennych i powstały przez hierarchiczne podziały, które towarzyszyły migracjom w Neolicie. Ludność pochodzenie Indoeuropejskiego utworzyła kasty wyższe.

26 Era postgenomiczna czyli DNA barcoding Idea kodu kreskowego DNA (ang. DNA barcoding) opiera się na założeniu, że krótka, odpowiednio dobrana, sekwencja DNA może pozwolić na ustalenie przynależności gatunkowej badanego osobnika, ponieważ zmienność genetyczna pomiędzy gatunkami jest większa od zmienności wewnątrzgatunkowej. Bazy danych kodu kreskowego DNA zawierają krótkie sekwencje DNA pochodzące od kilku osobników z każdego z dużej liczby gatunków. Uzyskany dla danego osobnika kod kreskowy DNA jest porównywany z biblioteką kodów pochodzących od osobników o znanej przynależności gatunkowej. W ten sposób osobnik jest albo identyfikowany, albo kierowany do analizy taksonomicznej.

27 Uniwersalny standard Różne genywykorzystywano do biosystematyki na poziomie gatunku, ale dąży się do tego, aby kody kreskowe DNA otrzymywać na bazie jednego, wybranego uniwersalnego standardu. Takim standardem stał się fragment 5 końca mitochondrialnego genu COI (cox1) >95% gatunków posiada unikalny kod kreskowy uzyskany na bazie sekwencji COI

28 W taksonomii kod kreskowy DNA może być użyty do identyfikacji gatunków. Uzyskanie kodu kreskowego wskazuje nietypowe osobniki, które następnie podlegają analizie taksonomicznej. Kody kreskowe pozwalają na wstępne posortowanie analizowanych organizmów. W genetyce populacyjnej kody kreskowe daja pierwsze, orientacyjne pojęcie o genetycznym zróznicowaniu danej populacji. W filogenetyce molekularnej baza kodów kreskowych pomaga w odpowiednim doborze gatunków do tworzenia drzew filogenetycznych. Można także wykorzystać zasoby tej bazy sekwencje i materiał biologiczny.