Deterministyczne i stochastyczne modele ścieżek regulatorowych związanych z apoptozą

Transkrypt

1 Politechnika Śląska Wyział Automatyki, Elektroniki i Informatyki Deterministyczne i stochastyczne moele ścieżek regulatorowych związanych z apoptozą Krzysztof Puszyński praca oktorska wykonana po kierunkiem r hab. Tomasza Lipniackiego GLIWICE 2009

2 2 Główne rezultaty mojej rozprawy oktorskiej opublikowane zostały w pracach: Krzysztof Puszyński, Beata Hat, an Tomasz Lipniacki, Oscillations an bistability in the stochastic moel of p53 regulation, J Theor Biol, 254(2): , Sep Krzysztof Puszyński, Roberto Bertolusso, Tomasz Lipniacki, Crosstalk between p53 an NF-κB systems: pro- an anti-apoptotic functions of NF-κB, IET Systems Biology - w publikacji. W rozprawie wykorzystano również następujące publikacje: Tomasz Lipniacki, Krzysztof Puszyński, Pawel Paszek, Allan R. Brasier, an Marek Kimmel, Single TNFα trimers meiating NF-κB activation: stochastic robustness of NFκB signaling, BMC Bioinformatics, 8:376, Beata Hat, Krzysztof Puszyński, Tomasz Lipniacki, Exploring mechanisms of oscillations in p53 an NF-κB systems, IET Systems Biology - w publikacji Niniejsza Rozprawa Doktorska była finansowana w ramach grantu promotorskiego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N

3 Spis treści 1 Wprowazenie Motywacja prowazonych baań i przemiot pracy Cel i tezy pracy Przewonik po rozziałach Położe biologiczne Streszczenie Buowa i ziałanie komórki Szlaki sygnałowe Czynnik transkrypcyjny p Czynnik transkrypcyjny NF-κB Apoptoza Dane eksperymentalne Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych Streszczenie Postawowe zależności wykorzystywane w moelowaniu Moelowanie stochastyczne czy eterministyczne? Algorytmy stochastyczne i przybliżenie eterministyczne Proceura opasowania moelu o anych Istniejące moele ścieżki sygnałowej NF-κB Streszczenie Moele grupy Hoffmana Moele Lipniackiego i współpracowników Struktura moelu Lipniackiego i współpracowników z roku (2007) Rezultaty moelu Lipniackiego i współpracowników Istniejące moele moułu regulatorowego p53 Mm Streszczenie Moel Wee i Agua Moele grupy Tysona Moel Ma i in. (2005) Moel Batchelora i in. (2008)

4 4 SPIS TREŚCI 6 Moel ścieżki sygnałowej p53 Mm Streszczenie Struktura moelu Równania Przybliżenie eterministyczne Rezultaty Moel łączny systemów NF-κB i p Streszczenie Znane połączenia ścieżek NF-κB IκBα i p53 Mm Struktura moelu Równania Przybliżenie eterministyczne Rezultaty Posumowanie 105 Bibliografia 115

5 Rozział 1 Wprowazenie 1.1 Motywacja prowazonych baań i przemiot pracy Gy zrowa komórka eukariotyczna starzeje się, staje się zbęna la tkanki i organizmu bąź ulega infekcji otrzymuje sygnał o samouśmiercenia na roze apoptozy. Decyzja o zaprogramowanej śmierci pojęta może zostać również przez samą komórkę w momencie wykrycia przez nią swego uszkozenia, a w szczególności uszkozenia materiału genetycznego. Komórki nowotworowe, posiaające zmutowane DNA i zagrażające tkance nie popełniają apoptozy. Stają się one unieśmiertelnione z powou nieprawiłowości występujących bąź to w samej ścieżce apoptozy bąź w moułach regulatorowych opowiezialnych za przekazanie sygnału o konieczności samounicestwienia, w szczególności w moule p53 Mm2. Zrozumienie procesów i zmian zachozących w czasie nowotworzenia oraz ich ientyfikacja prowazić mogą o lepszego poznania schorzenia, a w przyszłości o opracowania skutecznej metoy jego zwalczania. Eksperymenty biologiczne pozwalają na poznanie sieci połączeń pomięzy poszczególnymi białkami oziałującymi na siebie w komórce. Obecnie technika umożliwia obserwację zmian stężenia poszczególnych związków w pojeynczych komórkach czy nawet na obserwację pojeynczych cząsteczek we wnętrzu komórki, co aje możliwość zapoznania się z ynamika procesów w niej zachozących. Symulacje komputerowe pozwalają na jeszcze lepsze poznanie i zrozumienie złożonych sieci powiązań wraz z ynamiką oziaływań. Prawiłowo zbuowany moel, nie tylko w sposób prawiłowy oaje istniejąca wiezę biologiczną, lecz może służyć o stawiania i wstępnej weryfikacji hipotez, których uowonienie eksperymentalne jest ość kosztowne. Motywacją baań zaprezentowanych w niniejszej rozprawie była chęć lepszego zrozumienia naturalnych mechanizmów regulatorowych związanych z opornością immunologiczną, naprawą DNA i apoptozą; zapoznanie się z ziałaniem w przyrozie elementów takich jak pętle sprzężenia zwrotnego czy ukłay wzmacniające oraz zaznajomienie się z procesami prowazącymi o apoptozy. Motywacją baań była również chęć stworzenia moeli matematycznych pozwalających na oanie istniejących eksperymentów i przewiywanie zachowań ukłau przy różnych protokołach wymuszeń i warunkach ziałania jak na przykła wyciszenie niektórych białek; moeli, które umożliwią weryfikacje hipotez jak i ich stawianie, co pozwoli na lepsze planowanie bąź uniknięcie niepotrzebnych i kosztownych eksperymentów biologicznych. Przemiotem baań są moele stochastyczne szlaku sygnałowego p53 oraz jego połączeń ze ścieżką NF-κB i ich przybliżenia eterministyczne. Moele stochastyczne zbuowane zostały w oparciu o postulat Haseltine a i Rawlingsa [30] przyśpieszający algorytm

6 6 Wprowazenie Gillespiego [25]. Przybliżenia eterministyczne moeli stochastycznych zbuowane zostały w oparciu o równania różniczkowe zwyczajne (ODE). 1.2 Cel i tezy pracy Celem pracy było otworzenie w formie moelu matematycznego struktury ścieżek sygnałowych p53 i NF-κB na postawie istniejącej wiezy biologicznej, przyjętych założeń i uproszczeń oraz rozważań teoretycznych. Następnie takie obranie parametrów aby otworzyć obserwowane w eksperymentach zachowanie baanych ukłaów. Do celu pracy należy również analiza zbuowanych moeli i próba przewizenia ich zachowania w przypakach nie posiaających jeszcze weryfikacji eksperymentalnej. Przeprowazone baania symulacyjne pozwalają na postawienie następujących wóch tez: 1. Zaprezentowany w rozprawie moel ścieżki sygnałowej p53 zawiera wie pętle sprzężenia zwrotnego. Pętla ujemnego sprzężenia wraz z występującym w niej opóźnieniem związanym z transkrypcją i translacją Mm2 wprowaza o moelu cykl graniczny opowiaający za obserwowane eksperymentalnie oscylacje poziomów p53 i Mm2 występujące po uszkozeniu DNA. Sprzężenie oatnie, w którym w związku z obecnością białek pośrenich (PTEN, PIP3 i Akt) występuje znaczne opóźnienie, pełni rolę przełącznika wprowazając o ukłau bistabilność. Jeżeli naprawa uszkozonego DNA jest wyajna, komórka wraca z cyklu granicznego o pierwotnego stanu ustalonego kojarzonego z przeżyciem. Jeżeli naprawa jest nieskuteczna bąź zajmuje zbyt wiele czasu, ziałanie sprzężenia oatniego powouje ustalenie się wysokiego poziomu p53 w komórce przełączając ją z cyklu granicznego w rugi stan ustalony kojarzony z apoptozą. Stochastyczność procesu regulatorowego uwzglęniona w moelu umożliwia separację populacji komórek poanych naświetleniu na frakcję przeżywającą i apoptotyczną. 2. Zaproponowany moel łączny systemów NF-κB i p53, bęący pierwszą próba zamoelowania ynamiki interakcji obu czynników transkrypcyjnych, pozwala wyjaśnić obserwowane w eksperymentach anty- i pro-apoptotyczne zachowanie się NF-κB, uzależniając je o protokołu poawania wymuszeń. Stochastyczność procesów molekularnych pozwala na separację populacji komórek na wie frakcje: przeżywającą i polegającą apoptozie. Wielkość frakcji apoptotycznej przy ustalonej wielkości wymuszeń IR i TNFα zależy o kolejności ich poawania. Poanie TNFα prze naświetleniem zwiększa szansę komórek na przeżycie, poczas gy poanie go po naświetleniu zwiększa ich śmiertelność. 1.3 Przewonik po rozziałach Niniejsza rozprawa oktorska skłaa się z ośmiu rozziałów i bibliografii. Każy z rozziałów rozpoczyna się krótkim streszczeniem oraz omówieniem jego ukłau po którym następuje właściwa część. Rozział pierwszy stanowi wstęp, w którym przestawiłem motywację prowazonych baań, przemiot pracy, cel oraz jej tezy. W rozziale rugim omówiłem postawowe elementy wiezy biologicznej wykorzystane w moelowaniu. Przestawiłem buowę komórki po kątem elementów występujących

7 1.3. PRZEWODNIK PO ROZDZIAŁACH 7 w moelach takich jak receptory, cytoplazma z rybosomami, jąro komórkowe z zawartym w nim materiałem genetycznym. Wyjaśniłem pojęcie szlaku sygnałowego jak i istotę przesyłanego sygnału. W alszej części rozziału rugiego omówiłem obywa czynniki transkrypcyjne występujące w rozprawie, to jest NF-κB oraz p53 zwracając uwagę na pełnione przez nie w komórce funkcje jak i konsekwencje wynikające z powstania zaburzeń w ich regulacji. Przestawiłem pojęcie apoptozy wyjaśniając jej mechanizm i funkcje w organizmie. Na końcu rozziału zaprezentowałem przykłaowe ane biologiczne na postawie których opracowywana jest ynamika moeli. Rozział trzeci prezentuje prawa i zależności jakimi posłużyliśmy się przy buowie moeli takie jak prawo ziałania mas, kinetykę Michaelisa-Menten czy współczynnik Hilla. W części tej postarałem się również opowiezieć na pytanie o zasaność moelowania stochastycznego jak i eterministycznego szlaków sygnałowych. Przestawiłem algorytm Gillespiego bęący wzorcem moelowania stochastycznego oraz jego moyfikację τ-leap i postulat Haseltine a Rawlingsa, o który oparliśmy implementację numeryczną moeli stworzonych w ramach rozprawy. Wyjaśniłem sposób uzyskiwania przybliżenia eterministycznego jak i proceurę opasowywania moelu o anych eksperymentalnych. Rozziały czwarty i piąty opisują istniejące w literaturze moele szlaków sygnałowych opowienio NF-κB oraz p53. Przestawiłem w nich buowę i ynamikę istniejących rozwiązań. W sposób rozszerzony opisałem nasz moel ścieżki sygnałowej NF-κB stworzony w 2007 roku (Lipniacki i in. [56]), który stał się postawą o buowy moelu łącznego, przestawionego w rozziale siómym. Rozziały szósty i siómy stanowią główną część pracy oktorskiej prezentując zbuowane w jej ramach moele ścieżki sygnałowej p53 i łączny systemów NF-κB i p53. Rozział szósty zawiera okłany opis struktury stworzonego moelu p53 z uwzglęnieniem wiezy biologicznej na której oparliśmy poszczególne jego elementy, założeń i uproszczeń jakimi się posłużyliśmy. W alszej części rozziału szóstego zaprezentowałem parametry jak i równania moelu i jego przybliżenia eterministycznego. Ostatnią część rozziału szóstego stanowi przestawienie wyników symulacji uzyskanych przy różnych protokołach wymuszenia oraz różnych warunkach ziałania moelu (wyłączenie i załączenie procesów naprawczych DNA oraz proukcji białka PTEN). Rozział siómy rozpoczyna się o przestawienia znanych z literatury połączeń pomięzy ścieżkami NF-κB i p53. Następnie opisana jest wieza biologiczna, założenia i uproszczenia wykorzystane w buowie moelu łącznego. Kolejna cześć rozziału siómego prezentuje parametry oraz równania moelu stochastycznego i jego przybliżenia eterministycznego. Po niej następuje omówienie wyników symulacji moelu z uwzglęnieniem jego zolności o otwarzania wyników uzyskanych przez moele bazowe ( NF-κB i p53). Zaprezentowane też zostają wyniki symulacji moelu przy użyciu różnych protokołów zakłaających pobuzenie przez obywa sygnały wejściowe: TNFα i IR. Ósmy, ostatni rozział stanowi posumowanie rozprawy.

8 8 Wprowazenie

9 Rozział 2 Położe biologiczne 2.1 Streszczenie Rozział rugi zawiera krótki opis postawowych pojęć i wiezy biologicznej wykorzystanych poczas opracowywania moeli. Przestawiłem w nim istotne z punktu moelowania elementy komórki takie jak błona komórkowa z receptorami, jąro komórkowe zawierające materiał genetyczny i cytoplazma z zawartymi w niej rybosomami. Wyjaśniłem pojęcie szlaku sygnałowego i omówiłem czynniki transkrypcyjne p53 oraz NF-κB. Związane z tymi czynnikami ukłay regulatorowe są przemiotem rozprawy. Omówiłem skrótowo proces apoptozy oraz zaprezentowałem przykłaowe ane wykorzystywane przy opasowywaniu moeli zwracając uwagę na problemy pojawiające się przy ich pozyskiwaniu z populacji bąź z eksperymentów transfekcyjnych na pojeynczych komórkach. 2.2 Buowa i ziałanie komórki Opis wszystkich skłaników komórki i ich ziałania nie mieści się w ramach niniejszej rozprawy i może być znaleziony w większości poręczników biologii. Poniżej omówiłem elementy komórki, istotne w buowie prezentowanych moeli, po kątem ich roli w przekazywaniu sygnału. Błona komórkowa oziela wnętrze komórki o śroowiska zewnętrznego. Na jej powierzchni znajuje się wiele struktur służących na przykła ientyfikacji komórki przez mechanizmy obronne organizmu czy wykrywaniu boźców zewnętrznych ziałających w otoczeniu komórki. Struktury te nie pozostają w spoczynku, lecz ciągle przemieszczają się w sposób chaotyczny mający charakter ruchów Browna. Struktury białkowe wykrywające sygnał na zewnątrz komórki i w przypaku jego pojawienia się aktywujące białka sygnalizacyjne w cytoplazmie komórki zwane są receptorami. Na powierzchni komórki znajuje się wiele rozajów receptorów, z których każy reaguje zazwyczaj na jeen rozaj pobuzenia. Działanie receptorów można przestawić na przykłazie receptora TNFR1 wykorzystanego w rozprawie. Boźcem na który TNFR1 reaguje jest pojawienie się w otoczeniu komórki liganu TNFα (tumor necrosis factor alpha) występującego w postaci trymeru (trzech połączonych ze sobą cząsteczek). Przyłączenie się trymera TNFα o receptora powouje jego trymeryzację, czyli przyłączenie się o tak powstałego kompleksu wóch oatkowych receptorów. Część wewnętrzna tak stworzonego trymeru receptorowego zyskuje zolność przyłączania o siebie mięzy innymi cząsteczek RIP i TRAF2, co

10 10 Położe biologiczne prowazi o aktywacji całego kompleksu i uzyskania zolności aktywacji kinazy IKKK, przekazującej impuls w głąb komórki, poprzez opowieni szlak sygnałowy. Samoistne bąź wymuszone ołączenie się liganu bąź któregoś z białek o kompleksu receptora ezaktywuje go. Cytoplazma jest ukłaem koloialnym białek zawieszonych w roztworze wonym wypełniającym wnętrze komórki. W cytoplazmie znajują się organelle takie jak mitochonria, jąro komórkowe czy interesujące z punktu wizenia moelowania szlaków sygnałowych rybosomy, w których zachozi proces translacji mrna o postaci gotowego białka. Głównym zaaniem części cytoplazmatycznej omawianych w ramach niniejszej rozprawy szlaków sygnałowych jest wzmocnienie oebranego przez komórkę sygnału i przekazanie go o jąra komórkowego. Jąro komórkowe z perspektywy buowanych moeli jest miejscem w komórce, w którym przechowywany jest materiał genetyczny i w którym zachozi proces transkrypcji. Możliwe jest w nim również przekazywanie sygnału poobnie jak w cytoplazmie. Proukcja mrna w procesie transkrypcji zachozi po uaktywnieniu genu poprzez opowienie białko zwane czynnikiem transkrypcyjnym. W uproszczeniu przyjmuje się, iż kompleksy transkrypcyjne gotowe są o proukcji mrna i czekają jeynie na ołączenie się czynnika transkrypcyjnego o obszaru promotora. Po jego przyłączeniu proces transkrypcji przebiega z pełną możliwą szybkością o chwili samoistnego bąź wymuszonego ołączenia się czynnika transkrypcyjnego z wspomnianego obszaru. Normalna, niezmoyfikowana komórka posiaa wie kopie większości genów, z których każa może być aktywowana bąź ezaktywowana niezależnie. 2.3 Szlaki sygnałowe Szlakiem sygnałowym (ścieżką sygnałową, moułem regulatorowym) nazywamy zbiór reagujących ze sobą substratów takich jak białka, transkrypty, geny bąź receptory, współpracujących przy kontroli jenej lub więcej funkcji komórki. Sekwencyjne aktywację i ezaktywację białek (w szczególności kinaz białkowych) służą przetwarzaniu informacji i wypracowaniu właściwej opowiezi na stymulację. Skłaniki szlaku sygnałowego najczęściej tworzą strukturę łańcuchową ze sprzężeniami zwrotnymi. Proces przekazywania sygnału polega na fosforylacji, acetylacji bąź ubikwitynacji kolejnych typów białek jak na przykła (omówiona alej) aktywacja kinazy IKK przez kinazę IKKK czy (również omówiona alej) fosforylacja Akt przez PIP3. Szlak sygnałowy tworzą następujące mouły funkcyjne: Aktywacja i ezaktywacja receptorów - mouł służący wychwyceniu sygnału z otoczenia komórki i przekazaniu go w jej głąb. Wiele szlaków sygnałowych jak na przykła omówiony alej NF-κB rozpoczyna się o aktywacji receptorów. Prawopoobieństwo aktywacji receptora jest proporcjonalne o koncentracji aktywującej cytokiny w otoczeniu komórki. Jego ezaktywacja może być samoistna (na skutek ołączenia aktywatora lub enocytozy - wciągnięcia receptora o wnętrza komórki) bąź zależna o sygnałów zewnętrznych. Aktywacja i ezaktywacja genów - aktywacja genów następuje poprzez przyłączenie się czynnika transkrypcyjnego o obszaru promotora, co pozwala na rozpoczęcie procesu transkrypcji. Dezaktywacja związana jest z samoistnym bąź wymuszonym

11 2.4. CZYNNIK TRANSKRYPCYJNY P53 11 oczepieniem się cząsteczki czynnika transkrypcyjnego z tego obszaru lub przyczepieniem się represora. Transkrypcja i translacja - gen w stanie aktywnym proukuje mrna białka które kouje. Proukcja ta jest ciągła i trwa o czasu ezaktywacji genu. W jej wyniku jena kopia aktywnego genu może wyproukować kilkaziesiąt - kilkaset kopii mrna, które po przeostaniu się o cytoplazmy ulegają translacji w rybosomach, przy czym jena kopia mrna może stanowić matrycę la kilkuziesięciu czy kilkuset cząsteczek białka. Kaskay sygnałowe - w rezultacie aktywacji pojeynczej kopii genu powstaje kilkaziesiąt - kilkaset kopii mrna, a z nich kilkaziesiąt - kilkaset tysięcy kopii białka. Poobnie aktywna cząsteczka kinazy może służyć jako katalizator aktywacji kilkuziesięciu czy kilkuset cząsteczek kolejnych kinaz. Jeżeli bęą one aktywowały następne kinazy, to niewielka początkowo ilość aktywnych kinaz pierwszego rozaju skutkuje ogromną liczbą aktywnych kinaz na końcu łańcucha. Łańcuch kolejnych aktywacji prowazący o efektu wzmocnienia sygnału nazywany jest kaskaą sygnałową. Pętle ujemnego i oatniego sprzężenia zwrotnego - przepływ sygnału w komórce nie jest jenokierunkowy. Zazwyczaj w moułach regulatorowych jak na przykła w omówionych alej moułach p53 czy NF-κB występują liczne pętle sprzężeń zwrotnych zarówno ujemnych jak i oatnich. Powszechnie występujące sprzężenia ujemne jak na przykła aktywacja przez czynnik transkrypcyjny genu swego inhibitora zapewniają homeostazę komórki (istnienie stanu stacjonarnego). Sprzężenia ujemne związane ze znacznymi opóźnieniami mogą prowazić o występowania w komórce oscylacji (cykli granicznych). Sprzężenia oatnie wzmacniające sygnał jak na przykła aktywacja przez czynnik transkrypcyjny genu koującego inhibitor swego inhibitora wprowazają o ukłaów bistabilność, która umożliwia komórce pojęcie ecyzji (na przykła apoptoza czy proliferacja). 2.4 Czynnik transkrypcyjny p53 Luzkie białko p53 (oficjalna nazwa: cellular tumor antigen p53) skłaające się z 393 aminokwasów koowane jest przez gen TP53 położony na chromosomie 17. Okryte zostało w roku 1979 przez Lionela Crawfora, Davia Lane, Arnola Levine a i Lloya Ola. Po raz pierwszy luzki gen TP53 uało się sklonować w roku Początkowo sązono, iż p53 sprzyja powstawaniu nowotworów i opiero w 1989 roku Bert Vogelstein pokazał jego rolę przeciwziałającą powstawaniu raka. Nazwa p53 pochozi o jego masy molekularnej określanej na postawie węrówki po żelu w analizie SDS-PAGE wynoszącej 53 kda (kiloaltony). W roku 1993 p53 zostało ogłoszone cząsteczką roku przez magazyn Science. Białko p53 pełni rolę czynnika transkrypcyjnego, czyli cząsteczki wiążącej DNA w obszarze promotora, co umożliwia rozpoczęcie procesu transkrypcji genów. Zaangażowane jest w wiele procesów komórkowych, w szczególności w zatrzymanie cyklu komórkowego, procesy naprawcze DNA i proces apoptozy. Pełni ono rolę supresora nowotworowego uaktywniając się w momencie wykrycia uszkozenia czy mutacji DNA i w razie niepowozenia jego naprawy kierując komórkę na rogę samobójczej śmierci, latego zwane jest często strażnikiem genomu.

12 12 Położe biologiczne Mutacja w genie koującym p53 lub jego całkowity brak obserwowany jest w około połowie rozajów nowotworów. Pozostała ich część w większości wykazuje nieprawiłowości w funkcjonowaniu białek zaangażowanych w mouł regulatorowy p53 (np. PTEN). Dzieziczne mutacje w genie TP53 są przyczyną zespołu chorobowego Li-Fraumeni, który znacznie zwiększa szanse zachorowania na raka prze 45 rokiem życia. Poznanie pełnego mechanizmu regulacji i ziałania p53 może się przyczynić o wynalezienia leków hamujących rozwój nowotworu i wymuszających śmierć zmutowanych komórek. 2.5 Czynnik transkrypcyjny NF-κB Czynnik transkrypcyjny NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activate B cells) został okryty w roku 1986 przez Davia Baltimora. Nazwa NF-κB onosi się o kompleksu białek zbuowanego z NF-κB1 (p50) lub NF-κB2 (p52) oraz RelA (p65), RelB lub c-rel. Heteroimer p50 RelA(p65) jest najczęściej spotykaną formą i o niego onoszono się używając w rozprawie nazwy białko NF-κB. Białko NF-κB pełni rolę czynnika transkrypcyjnego la szeregu genów związanych mięzy innymi z opowiezią komórki na boźce zewnętrzne takie jak stres, cytokiny, wolne roniki czy antygeny. Głównym jego zaaniem jest jenak regulacja wczesnej opowiezi immunologicznej na infekcje oraz regulacja genów opowiezialnych za procesy proliferacji i przeżycia komórki. Mutacje genu NF-κB bąź nieprawiłowości w ukłazie regulatorowym białka NF-κB prowazić mogą o zapaleń, chorób autoimmunologicznych, szoku septycznego, zmniejszenia oporności na infekcje wirusowe jak również o powstawania i rozwoju raka. Mutacja genu NF-κB bąź jego inhibitora z roziny IκB prowazi w komórkach nowotworowych o ciągłej aktywności białka NF-κB, co umożliwia im proliferację. Dezaktywacja NF-κB może oprowazić o ich obumierania jak również zwiększyć ich wrażliwość na leki. Z tego powou NF-κB i jego mouł regulatorowy poobnie jak p53 ze swym ukłaem regulacji są jenymi z najczęstszych obiektów baań związanych z rakiem. 2.6 Apoptoza Termin apoptoza oznaczający zaprogramowaną śmierć komórki wprowazony został opiero w roku 1972, pomimo, że już w 1842 Carl Vogt opisał jej główne założenia. Apoptoza jest sposobem na pozbycie się przez tkankę starych bąź uszkozonych komórek w sposób nie powoujący stanu zapalnego. W oróżnieniu o nekrozy (martwicy) w jej trakcie nie ochozi o rozerwania błony komórkowej i wycieku wnętrza komórki. Przebiegiem procesu apoptozy sterują enzymy proteolityczne z grupy kaspaz. W jej trakcie chromatyna jąrowa ulega konensacji, DNA zostaje pocięte przez nukleazy takie jak DFF czy CAD na kawałki o ługości około 180 par zasa. W mięzyczasie następuje niszczenie cytoszkieletu komórki. W rezultacie orywa się ona o tkanki, a na jej powierzchni formują się charakterystyczne pęcherzyki, zwane ciałkami apoptotycznymi, zawierające w sobie nienaruszone organelle komórkowe. W końcowym etapie pęcherzyki orywają się o pozostałości komórki i zostają pochłonięte przez fagocyty. Apoptoza może być inukowana na skutek pojawiania się nienaprawialnych uszkozeń organelli komórkowych bąź zawartego w komórce DNA, infekcji wirusowej lub utrzymującego się stanu stresu czy nieożywienia. Sygnał inicjujący apoptozę pochozić może z wnętrza komórki bęąc reakcją

13 2.7. DANE EKSPERYMENTALNE 13 na uszkozenie, o otaczającej komórkę tkanki, gy komórka staje się w niej zbęna bąź o komórek immunologicznych, które skanując błonę komórkową sprawzają czy baana komórka nie została zainfekowana i w przypaku wykrycia zagrożenia aktywują na niej tak zwany receptor śmierci. Każego nia w ciele orosłego człowieka miliony komórek umierają rogą apoptozy umożliwiając onawianie się tkanek. Równie ważną rolę ogrywa apoptoza w procesie kształtowania się organizmów jak na przykła w procesie rozzielania się palców w kończynach człowieka. Zaburzenia procesu apoptozy prowazą o zwiększenia oporności komórek na stres i są cechą charakterystyczną nowotworów. W komórkach rakowych poprzez mutację kluczowych białek zablokowana jest sama ścieżka apoptotyczna kaspaz bąź ścieżki sygnałowe inukujące sygnał apoptotyczny jak na przykła ścieżka p53. Powouje to, że pomimo, iż DNA komórki zostaje znacznie zmienione w stosunku o stanu pierwotnego i komórka zaczyna zachowywać się w sposób zagrażający tkance jak i całemu organizmowi, to nie reaguje na sygnały próbujące zmusić ją o śmierci. Z powou ewientnego związku zaburzeń w procesie apoptozy z występowaniem nowotworów oraz teoretyczną możliwością uśmiercania komórek rakowych po usunięciu tych zaburzeń, programowana śmierć komórki znajuje się wśró najczęściej baanych mechanizmów biologicznych. 2.7 Dane eksperymentalne Dane eksperymentalne, o których opasowywane są moele szlaków sygnałowych, nie są anymi ilościowymi. Rezultaty często przestawiane są w literaturze w postaci tak zwanych blotów (rysunek 2.1) bąź zjęć ukazujących zmiany poziomów oznaczonych związkiem fluorescencyjnym białek (rysunek 2.2a). Obywa sposoby przestawiania anych ają obraz jakościowy charakteru opowiezi na zastosowany protokół wymuszeń. Prezentowane wykresy przebiegów zmienności poziomów białek jak na rysunku 2.2b onoszone są o jenostek umownych. Z tak przestawionych wyników można oczytać charakter zachowania się ukłau jak na przykła występowanie nietłumionych oscylacji, stałe czasowe takie jak okres rgań czy przesuniecie w fazie kolejnych zmiennych. Niemożliwe jest natomiast bezwzglęne określenie stężenia czy ilości molekuł konkretnego białka w określonym czasie. Dane zaprezentowane na rysunku 2.1 pochozą z pracy Lee i in. [51]. Przestawiają one zmiany poziomu NF-κB (panel A) oraz IκBα (panel B) w komórkach niezmoyfikowanych (+/+) i pozbawionych genu A20 (-/-), które poano ciągłemu wymuszeniu za pomocą 10 ng/ml TNFα. Zmiany w poziomie czynnika transkrypcyjnego (panel A) zostały zmierzone przy użyciu techniki EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), zaś jego inhibitora (panel B) za pomocą Western-blot. Obywie te techniki wykorzystują materiał pozyskany z frakcji komórek i wyniki uzyskane za ich pomocą są wynikami populacyjnymi. Eksperymenty populacyjne, pomimo, iż tańsze i ające wyniki mówiące o ogólnej tenencji komórek o pewnego typu zachowań nie są w stanie oać zachowania się pojeynczej komórki. W skrajnym przypaku można sobie wyobrazić oświaczenie, w którym komórki zielą się po równo na wie frakcje, z których jena posiaa wysoki poziom pewnego białka, zaś ruga niski. Analiza populacyjna sugerować bęzie w tym przypaku istnienie śreniego poziomu przemiotowego białka w populacji, co jest wynikiem błęnym, nie oającym faktycznego zachowania się żanej z komórek. Poobnie oscylacje występujące w populacji na poziomie komórkowym w związku z esynchronizacja komórek azą przy

14 14 Położe biologiczne analizie populacyjnej wynik nie ozwiercielający faktycznego ich zachowania [54]. Rysunek 2.1: Dane z eksperymentu populacyjnego zaprezentowane przez Lee i in. w [51], uzyskane za pomocą techniki EMSA (panel A) bąź Western-blot (panel B). Panele A i B prezentują zmianę poziomów NF-κB i IκBα w komórkach poanych ciągłemu wymuszeniu awką 10 ng/ml TNFα, w których zablokowano (-/-) bąź nie (+/+) proukcje białka A20. W oróżnieniu o powyższych wyników ane pokazane na rysunku 2.2 pochozące z pracy Geva-Zatorsky i in. [24] obrazują opowiezi pojeynczych komórek na ziałanie boźca jakim było naświetlenie awką 5 lub 2.5 Gy. Wykorzystana w [24] technika eksperymentu zwana transfekcją polega na wprowazeniu o komórki opowienio zmoyfikowanych kopii genów białek, które mają polegać obserwacji. Do spreparowanych genów oczepiane są końcówki koujące części fluorescencyjne. W przypaku prezentowanego eksperymentu zielonym fluorescentem oznaczono gen p53, a czerwonym Mm2. Panel A przestawia wyniki uzyskane la przykłaowej komórki przy wymuszeniu awką 5 Gy. Pierwszy rysunek panelu B przestawia zmiany poziomów oznaczonych białek la komórki z panelu A, pozostałe rysunki przestawiają kolejne baane komórki przy czym w ich przypaku zastosowano wymuszenie awką 2.5 Gy. Jak wiać opowiezi poszczególnych komórek posiaają ten sam typ jakościowy wyrażający się istnieniem nietłumionych oscylacji o okresie około 5.5 goziny i wyraźnym przesunięciu w oscylacjach p53 i Mm2. Wioczna jest również esynchronizacja w opowiezi na ten sam boziec pomięzy komórkami 2-6 wynikającą z istniejących w ukłazie stochastyczności. Pomimo, iż opisana powyżej technika pozwala na obserwację i pozyskanie wyników z pojeynczych komórek posiaa wie zasanicze way. Pierwsza z nich wynika ze sposobu zamiany informacji z kamery rejestrującej zmiany poziomów intensywności poszczególnych fluorescentów na opowienie wykresy. Operacja ta nie jest zautomatyzowana, lecz przeprowazana przez człowieka, który obserwując kolejne zarejestrowane klatki filmu zaznacza

15 2.7. DANE EKSPERYMENTALNE 15 obszary z których oczytany ma być poziom intensywności świecenia. Powouje to ość uże zniekształcenia faktycznego zachowania się komórki oraz utrunienia w otworzeniu otrzymanych wyników przez innych baaczy. Główną waą metoy jest pojawiająca się Rysunek 2.2: Dane z eksperymentu Geva-Zatorsky i in. [24] na pojeynczych komórkach MCF7 uzyskane przy użyciu transfekcji genów ze znacznikiem fluorescencyjnym. Kolorem zielonym oznaczono białko p53, kolorem czerwonym Mm2. Panel A i pierwszy rysunek panelu B przestawiają tą sama komórkę poaną promieniowaniu 5 Gy. Pozostałe rysunki panelu B przestawiają opowiezi kolejnych komórek poanych wymuszeniu 2.5 Gy. przy transfekcji zmiana ilości kopii baanych genów. Nie zawsze istnieje możliwość wygaszenia niezmoyfikowanych kopii genu w jąrze komórkowym, czasami jest to zbyt trune bąź kosztowne, poobnie jak okłane określenie ilości wprowazonych o komórki i aktywnych kopii zmoyfikowanego genu. Prowazi to o sytuacji gy komórka posiaa więcej niż normalne wa geny anego typu. Doatkowo wprowazone o komórki namiarowe kopie proukować bęą białko oznaczone, zaś geny normalne białko nieoznaczone. Obywa

16 16 Położe biologiczne jego rozaje spełniają swoje normalne funkcje w organizmie, więc oczyt opowienich poziomów może być obarczony sporym błęem. Co więcej wprowazenie oatkowych kopii anego genu powouje ze jego proukcja jest kilkukrotnie szybsza niż w komórkach nie zmoyfikowanych, co prowazi o zaburzeń w baanych szlakach i możliwe staje się, że obserwowany w eksperymencie efekt nie jest specyficzny la zaanego wymuszenia i nie występuje w ogóle bąź nie z taką siłą w komórkach niezmienionych o których zachowaniu tak naprawę chcemy wnioskować. Możliwa jest zatem sytuacja, w której obserwowane w ukłazie p53 oscylacje nie wynikają z rzeczywistej jego opowiezi na napromieniowanie, lecz są artefaktem metoy [31].

17 Rozział 3 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych 3.1 Streszczenie Buowa moeli matematycznych wymaga stworzenia równań aekwatnych o wybranej metoy moelowania jak na przykła algorytm Gillespiego czy moelowanie za pomocą ODE. Równania te powinny opierać się na znanych prawach i zależnościach, zaś parametry muszą pozwolić by moel jak najlepiej owzorowywał rzeczywistość, przy czym ich wartości nie mogą przekraczać fizycznych ograniczeń takich jak na przykła maksymalne tempo transkrypcji. Aparat numeryczny wykorzystany o znalezienia rozwiązania powinien zapewnić szybkie uzyskanie wyniku przy jenoczesnej minimalizacji błęów metoy. Rozział trzeci rozprawy poświecony jest omówieniu postawowych praw i zależności wykorzystanych przy buowie moeli opisanych w rozziałach 5-7, przestawieniu najpopularniejszych algorytmów moelowania jak i proceury znajowania parametrów tworzonych moeli. W rugiej części rozziału trzeciego przestawiono prawo ziałania mas, równanie Michaelisa-Menten oraz znaczenie współczynnika Hilla. Trzecia cześć rozziału poświecona jest opowiezi na pytanie o zasaność stosowania moeli stochastycznych lub eterministycznych. Cześć czwarta zawiera opisy najpopularniejszych rozajów moelowania stochastycznego takich jak algorytm Gillespiego, jego moyfikacja τ-leap oraz zastosowane w pracy poejście zaproponowane przez Haseltine a i Rawlingsa. Znajuje się w niej także opis sposobu uzyskiwania przybliżenia eterministycznego. Kolejna cześć omawia proceurę znajowania wartości parametrów w trakcie opasowywania moelu o anych zwaną potocznie fitowaniem (ang. fitting). 3.2 Postawowe zależności wykorzystywane w moelowaniu Moelowanie ścieżek sygnałowych opiera się na prawach znanych z biochemii. Reagujące ze sobą białka rozpatrywane są w ten sam sposób, co występujące w terminologii biochemicznej enzymy, proukty i substraty. Poniżej omówiłem główne zależności wykorzystywane w moelowaniu ścieżek sygnałowych.

18 18 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych Prawo ziałania mas Postawowe prawo używane w chemii, biochemii i moelowaniu szlaków sygnałowych. Pierwszy raz zaproponowane zostało w roku 1864 [92], często o nazwisk swych twórców zwane jest prawem Gulberga i Waagego. Zgonie z nim, przy założeniu, że prawopoobieństwo zerzeń reagujących ze sobą cząsteczek nie zależy o tego, co się z nimi ziało wcześniej, a jeynie o ich obecnej ilości w jenostce objętości i śreniej energii kinetycznej ich ruchu, szybkość reakcji chemicznej jest proporcjonalna o stężenia wszystkich uczestniczących w niej reagentów. Co wynika z faktu, iż szybkość reakcji zależy o ilości zerzeń reagujących ze sobą cząsteczek w jenostce czasu. Z powyższego sformułowania wynikają ość oczywiste wnioski. Po pierwsze jeżeli stężenie któregoś z substratów jest zerowe, to reakcja nie zachozi. Po rugie zwiększenie stężenia substratów powouje przyśpieszenie reakcji, poczas gy zmniejszenie stężenia któregokolwiek z nich jej spowolnienie. Po trzecie, przy reakcjach równowagowych, gy reakcja zachozi w obie strony w ukłazie zamkniętym, to przyśpieszenie jej w jenym kierunku na przykła poprzez użycie katalizatora powouje automatyczne jej przyśpieszenie w kierunku przeciwnym. Tym samym stężenie substratów i prouktów w takim ukłazie jest stałe i nie można go zmienić przy użyciu katalizatorów. W moelach stworzonych w ramach rozprawy wykorzystano wa typy reakcji oparte o prawo ziałania mas: reakcje aycji oraz reakcje równowagową. Reakcja aycji to prosta reakcja łączenia się kilku substratów w jeen proukt finalny. Na przykła wa białka A i B łączą się w finalny kompleks AB przy czym reakcja ta nie jest owracalna (czyli kompleks AB nie rozpaa się na A i B). A + B AB (3.1) Tempo powyższej reakcji zależy o prawopoobieństw efektywnych zerzeń A i B, co przy założeniu, iż prawopoobieństwa te są proporcjonalne o aktywności chemicznych oziałujących substratów można zapisać jako: r = k A B (3.2) gzie k to współczynnik szybkości reakcji, zaś r to tak zwana szybkość zaniku substratów A i B. Zakłaając, iż kompleks AB nie ulega alszym przemianom, rozpaowi czy egraacji można zapisać różniczkowe równanie szybkości jego powstawania. Bęzie miało ono postać: AB(t) = k A(t) B(t). (3.3) t Reakcja równowagowa, to reakcja owracalna, czyli taka, gzie powstający z białek A i B kompleks AB może się ponownie rozpaać na pojeyncze cząsteczki A i B.

19 3.2. PODSTAWOWE ZALEŻNOŚCI WYKORZYSTYWANE W MODELOWANIU19 A + B AB, (3.4) co przy założeniu, iż białka A i B oraz kompleks AB nie biorą uziału w żanych innych reakcjach aje równanie różniczkowe opisujące tempo zmian ilość kompleksu w postaci: t AB(t) = k a A(t) B(t) k AB(t) (3.5) gzie k a jest współczynnikiem szybkości reakcji powstawania kompleksów, zaś k współczynnikiem szybkości ich rozpau. Równanie Michaelisa-Menten W roku 1913 Leonor Michaelis i Mau Menten zaproponowali opis reakcji katalitycznych (enzymatycznych), to jest takich, w których ziałanie enzymów powouje ogromne przyśpieszenie przekształcania się substratów w proukt [65]. W opisie tym zakłaa się, że proukt nie może być ponownie przekształcony w substraty oraz, że enzymy nie łącza się z prouktem. Reakcja ma więc postać: E + S ES E + P (3.6) Oznaczając przez k 1 tempo powstawania kompleksu ES, przez k 2 powstawania prouktu P i enzymu E z kompleksu ES oraz przez 1 tempo rozpau kompleksu ES na enzym i substraty S możemy zapisać różniczkowe równanie opisujące tempo zmian ilości kompleksu ES t ES(t) = k 1 E(t) S(t) 1 ES(t) k 2 ES(t) (3.7) zakłaając następnie, iż koncentracja kompleksów ES zmienia się użo wolniej niż koncentracja substratów i prouktu, a także, iż ilość substratów jest na tyle uża, że można zaniebać ich ubytek w wyniku reakcji oraz, iż ilość enzymu w trakcie trwania reakcji się nie zmienia, czyli: ES(t) = 0 (3.8) t S(t) = 0 (3.9) t E tot = E(t) + ES(t) = const (3.10) otrzymujemy 0 = k 1 (E tot ES(t)) S(t) ( 1 + k 2 ) ES(t), (3.11)

20 20 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych co po przekształceniach aje Wprowazając S(t) E tot = S(t) ES(t) + ES(t) 1 + k 2 k 1. (3.12) k M = 1 + k 2 k 1 (3.13) oznaczające stałą Michaelisa-Menten oraz przekształcając równanie 3.12 o postaci S(t) E tot = (k M + S(t)) ES(t) (3.14) otrzymujemy ES(t) = S(t) E tot k M + S(t), (3.15) co po postawieniu o zależności wyrażającej tempo zmiany ilości prouktu t P (t) = k 2 ES(t) = v 0 (3.16) aje równanie wyrażające szybkość reakcji v 0 (powstawania prouktu P ) w zależności o stężenia substratów zwane równaniem Michaelisa-Menten: v 0 = v max S(t) k M + S(t) (3.17) gzie v max = k 2 E tot oznacza maksymalną możliwą prękość tej reakcji, zaś stała k M może być interpretowana jako stężenie substratu, przy którym reakcja osiąga połowę swej maksymalnej prękości. Współczynnik Hilla W roku 1910 Archibal Vivian Hill baając proces przyłączania się cząsteczek tlenu o hemoglobiny zauważył, że jeżeli wiele cząsteczek hemoglobiny skupi się ze sobą, to przyłączanie tlenu jest wyajniejsze [33]. Poobne zachowanie jak i proces owrotny polegający na osłabieniu reakcji przy zwiększającym się skupieniu jenego z reagentów obserwowane jest w wielu procesach. W celu opisu tej zależności stosuje się wprowazony przez Hilla współczynnik (n) nazwany jego nazwiskiem. Wartość współczynnika Hilla równa 1 oznacza całkowicie niezależne przyłączanie się liganu, wartość współczynnika większa o jeności oznacza ziałanie pozytywne w sensie zwiększania się przyczepności liganu w obecności innych liganów, zaś wartość współczynnika mniejsza o jeność ziałanie osłabiające przyczepność. Ogólnie równanie opisujące ilość zajętych przez ligan miejsc (Q) wykorzystujące współczynnik Hilla nazywa się równaniem Hilla i ma ono postać:

21 3.3. MODELOWANIE STOCHASTYCZNE CZY DETERMINISTYCZNE? 21 Q = Ln k n + L n (3.18) gzie L oznacza koncentracje liganu, zaś k taką jego koncentrację, przy której zajęta jest połowa miejsc przyłączeniowych. Jak można zauważyć przy n = 1 i wprowazeniu opowieniego współczynnika postać równania Hilla opowiaa równaniu Michaelisa-Menten. 3.3 Moelowanie stochastyczne czy eterministyczne? Żywą komórkę można rozpatrywać jako złożony reaktor biochemiczny, w którym oziałują ze sobą cząsteczki białek zgonie ze specyficznymi la nich regułami reakcji. Tempa samych oziaływań uzależnione są o stężenia reagujących ze sobą skłaników jak również o warunków śroowiska, które mogą być prezentowane w równaniach przez współczynniki reakcji. Ogólnie każe zachozące w baanym reaktorze zjawisko jak np. połączenie się po jenej cząsteczce wu substratów w jeną cząsteczkę prouktu powinno być traktowane jako zarzenie losowe. Prawopoobieństwo zajścia takiego zarzenia, a co za tym izie również sama chwila jego zajścia ściśle związane są ze wspomnianymi parametrami. Co więcej pojeyncze zarzenie losowe jak na przykła aktywacja jenej kopii genu prowazić może o powstania z niego kilkuziesięciu tysięcy kopii opowieniego białka czego wpływ na komórkę bęzie ogromny. Sam opis stochastyczny skomplikowanych ukłaów jak na przykła rozbuowane ścieżki sygnałowe nastręcza jenak pewnych truności, oatkowo uzyskany moel stochastyczny jest ciężki w analizie. Problematyczne jest owoływanie się w niej o pojęć znanych z ukłaów eterministycznych takich jak punkty stabilne czy cykle graniczne, które to pojęcia wykorzystano w analizie buowanych moeli w alszych rozziałach. Z tych powoów pożąana byłaby możliwość opisu zachowania się baanego ukłau przy pomocy jeynie równań różniczkowych i uzyskanie w ten sposób moelu eterministycznego. Oprócz wspomnianej wyżej łatwości analizy i możliwości owoływania się w niej o znanych pojęć, moele eterministyczne umożliwiają okonanie analizy bifurkacyjnej (wykorzystanej przez nas o baania oporności moeli ścieżki sygnałowej p53 Mm2 przestawionej w Hat i in. [31]) oraz charakteryzują się znacznie większą szybkością ziałania niż moele stochastyczne. Moelowanie eterministyczne posiaa jenak zasaniczą waę. Jak można zauważyć w wielu eksperymentach jak na przykła w [24] poszczególne komórki należące o tej samej tkanki wykazują zróżnicowaną opowieź na okłanie ten sam boziec zewnętrzny. Opowieź ta może iametralnie się różnić pomięzy komórkami jak na przykła opowieź na uszkozenie DNA powstałe na skutek promieniowania IR może przyjąć formę przeżycia bąź apoptozy, czyli samobójczej śmierci. Opis eterministyczny w swej specyfice nie pozwala na uzyskanie zróżnicowanych opowiezi przy założeniu tych samych warunków początkowych, parametrów i takiej samej wartości pobuzenia. Interpretacja wyniku uzyskanego z moelu eterministycznego jako śrenie zachowanie się komórek może okazać się mylna i takie śrenie zachowanie z powou esynchronizacji występującej pomięzy pojeynczymi komórkami tak naprawę nie bęzie oawało żanego z obserwowanych oświaczalnie zachowań [55]. Zatem gy zależy nam na opisie zachowania się pojeynczych komórek, wykazujących uże zróżnicowanie w opowiezi na boźce, koniecznym staje się stosowanie moeli stochastycznych. W celu owoływania się w analizie tych moeli o pojęć znanych z ukłaów ciągłych obrze jest

22 22 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych posiaać przybliżenie eterministyczne baanego moelu stochastycznego. Takie poejście zastosowałem w niniejszej rozprawie. 3.4 Algorytmy stochastyczne i przybliżenie eterministyczne Powszechnie stosowanym algorytmem służącym o moelowania procesów stochastycznych zachozących w komórkach jest algorytm Gillespiego. Jest to w pełni stochastyczne poejście o moelowania, co pociąga za sobą uże obciążenie obliczeniowe i wynikającą stą czasochłonność obliczeń. Z tego powou powstały liczne moyfikacje mające na celu jego przyspieszenie. Sam algorytm oraz wybrane usprawnienia, łącznie z poejściem stosowanym w rozprawie omówiłem poniżej. Algorytm Gillespiego Zanim Dan Gillespie opublikował w roku 1977 pracę prezentującą jego algorytm symulacji reakcji chemicznych stosowano traycyjną metoę wyznaczania zmian stanu takiego ukłau w czasie. Polega ona na zbuowaniu równania głównego (ang. master equation), a następnie jego rozwiązaniu. W takim poejściu system opisywany jest przez zbiór równań różniczkowych, w których zmiennymi są prawopoobieństwa znajowania się ukłau w anym czasie w określonym stanie. Każy możliwy stan ukłau wymaga ozielnej zmiennej, więc ukła równań gwałtownie rozrasta się w miarę jak zwiększa się liczba rozajów związków biorących uział w reakcji jak i cząsteczek każego z tych związków. Rozwiązanie takiego ukłau okazuje się barzo trune. Gillespie zaproponował by symulować tylko jeną trajektorię systemu, a następnie użyć statystyki o estymacji koncentracji cząsteczek [25]. W ujęciu Gillespiego symulacja stochastyczna służy o opisania zmian w czasie wektora stanu S(t) przy założeniu stanu początkowego S(0). W każym kroku symulacji ukła znajuje się w okłanie jenym określonym stanie, w którym należy pojąć wie ecyzje: po jakim czasie o chwili obecnej zajzie następna reakcja która z możliwych reakcji zajzie w tym czasie By opowiezieć na powyższe pytania Gillespie efiniuje funkcję gęstości prawopoobieństwa reakcji P (µ, τ): P (µ, τ) τ jest prawopoobieństwem, iż reakcja R µ zajzie w nieskończenie małym przeziale czasu (t + τ, t + τ + τ) zakłaając, że w czasie t system znajuje się w stanie S(t) Warto zauważyć, że funkcja gęstości P (µ, τ) z założenia jest proporcjonalna jeynie o τ. Prawopoobieństwo P (µ, τ) τ oblicza się z zależności: P (µ, τ) τ = P 0 (τ) P µ (τ) (3.19) gzie P µ (τ) = a µ τ (3.20)

23 3.4. ALGORYTMY STOCHASTYCZNE I PRZYBLIŻENIE DETERMINISTYCZNE 23 jest prawopoobieństwem tego, iż reakcja R µ zajzie w przeziale czasu (t+τ, t+τ +τ), zaś a µ oznacza skłonność (ang. propensity) zajścia reakcji µ. P 0 (τ) jest prawopoobieństwem, że przy anym w chwili t stanie S(t) żana z reakcji nie zajzie w przeziale czasu (t, t + τ). Bazując na powyższym, prawopoobieństwo, że którakolwiek z możliwych M reakcji zajzie we wspomnianym przeziale czasu wynosi M P (τ) = a µ τ = a τ (3.21) µ=1 Tak więc prawopoobieństwo, iż w przeziale τ nie zajzie żana reakcja wynosi 1 a τ stą P 0 (τ + τ) = P 0 (τ) (1 a τ), (3.22) co można przestawić w postaci równania różniczkowego jako P 0 τ = a P 0, (3.23) którego rozwiązanie ma postać P 0 (τ) = e a τ (3.24) Bazując na powyższych równaniach, z rozkłau łącznego można otrzymać prawopoobieństwo, że którakolwiek z możliwych reakcji zajzie w przeziale czasu (t+τ, t+τ +τ) sumując równanie 3.19 po wszystkich reakcjach M P (τ) τ = P (µ, τ) τ = a e a τ τ (3.25) µ=1 Warto zauważyć, iż równanie 3.25 aje nam prawopoobieństwo, że którakolwiek z reakcji zajzie w przeziale czasu τ, a nie w określonym czasie. stą potrzeba założenia, iż τ jest pomijalnie małe. Daje to postawę o wyznaczenia okłanego, czasu kiey zajzie kolejna reakcja. Prawopoobieństwo, że reakcja która zajzie w czasie τ bęzie typu µ jest prawopoobieństwem warunkowym P (µ, τ) i jako takie wyraża się wzorem: P (µ τ) = P (µ, τ) P (τ) = a µ e a τ a e a τ = a µ a (3.26) Równania 3.25 oraz 3.26 ają nam prawopoobieństwa opowiaające na pytania kiey zajzie następna reakcja i jakiego typu ta reakcja bęzie.

24 24 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych W celu ujęcia powyższych równań w algorytm obliczeniowy potrzebne są kolejne przekształcenia. Chcąc wyznaczyć okłany czas, w którym zajzie kolejna reakcja, trzeba skorzystać z funkcji gęstości prawopoobieństwa la równania 3.25, która ma postać P (τ) = a e a τ (3.27) stą jej ystrybuanta zefiniowana jest jako F (t) = t t P (τ) τ = a e a τ τ = 1 e a t 0 (3.28) Mając ana liczbę r 1 wylosowaną z rozkłau równomiernego z przeziału < 0, 1 >, chcąc wybrać czas t tak by F (t) = r 1 i korzystając z faktu, iż postać funkcji gęstości la t bęzie taka jak w równaniu 3.27, można wyznaczyć wartość t z zależności: t = F 1 (r 1 ) = 1 ( ) 1 a ln 1 r 1 (3.29) Liczba r 1 pochozi z rozkłau równomiernego z przeziału < 0, 1 >, więc wyrażenie 1 r 1 może zostać zastąpione przez r 1, co aje nam czas τ o następnej reakcji równy: τ = 1 a ln ( 1 r 1 ) = 1 a ln r 1 (3.30) Typ reakcji jaka zajzie w tak ustalonym czasie można określić korzystając z zależności Jeżeli wylosowana zostanie liczba r 2 z rozkłau równomiernego z przeziału < 0, 1 >, to typ reakcji która zajzie w chwili τ opowiaa takiemu µ, które spełnia nierówność: µ 1 j=1 a j a r 2 < µ j=1 a j a (3.31) Przy powyższych przekształceniach można już sformułować algorytm Gillespiego: 1. Ustal t = 0 oraz początkowe ilości wszystkich cząsteczek biorących uział w reakcji. Zainicjuj generator liczb pseuolosowych 2. Dla anego czasu t oraz ilości molekuł przelicz wszystkie funkcje skłonności a µ oraz wyznacz a = M µ=1 a µ 3. Wylosuj wie liczby r 1 i r 2 z rozkłau równomiernego z przeziału < 0, 1 >. Znajź τ = (1/a )ln(1/r 1 ) oraz takie µ, które spełnia nierówność: µ 1 j=1 a j r 2 a < µ j=1 a j 4. Zmień ilości molekuł zgonie z schematem wylosowanej reakcji R µ, postaw czas t = t + τ 5. Sprawź czy osiągnięto czas T końca symulacji lub czy wszystkie a µ = 0, jeżeli tak,

25 3.4. ALGORYTMY STOCHASTYCZNE I PRZYBLIŻENIE DETERMINISTYCZNE 25 zakończ obliczenia, jeżeli nie, wróć o punktu 2. Moyfikacja τ leap Postawowy algorytm Gillespiego, pomimo, iż w sposób znaczący ułatwia rozwiązanie problemu moelowania stochastycznego posiaa również zasaniczą waę. Po wylosowaniu czasu zajścia następnej reakcji τ oraz typu reakcji która zajzie określanego przez µ przeprowaza się okłanie jeną reakcje wylosowanego typu. Przykłaowo jeżeli posiaamy sto tysięcy cząsteczek A i sto tysięcy cząsteczek B, które w reakcji R µ łączą się z sobą tworząc kompleks AB, to jeżeli reakcja µ okaże się reakcją zwycięską, to w chwili t + τ okłanie jena cząsteczka A połączy się z jeną cząsteczką B tworząc jeen kompleks AB. Zakłaając więc nieowracalność tej reakcji oraz brak innego typu reakcji w systemie, o pełnego przereagowania A i B potrzeba sto tysięcy kroków algorytmu Gillespiego w jego formie postawowej. Jest to przyczyną użego obciążenia obliczeniowego algorytmu. Gillespie [26] zauważa, że przy założeniu użej ilości cząsteczek A i B w systemie stan ukłau mięzy chwilami t i t + τ zmienia się minimalnie. Zakłaając oatkowo, że reakcja zachozi szybko, to znaczy skłonność o zajścia reakcji jest barzo wysoka na mocy 3.30 uzyskujemy czas τ ążący o zera. Tak więc po wykonaniu pojeynczego kroku algorytmu ukła znajuje się w przybliżeniu w tym samym stanie co prze jego wykonaniem. W związku z tym prawopoobieństwa typów reakcji w następnym kroku są poobne o tych w kroku poprzenim. Przejścia pomięzy kolejnymi stanami ukłau mają charakter procesu Markowa, więc w anej chwili t o wykonania kolejnego kroku nie musimy znać okłanej kolejności zachozenia poprzenich reakcji. Do poznania bieżącego stanu ukłau wystarczy informacja ile razy każa z reakcji zaszła o chwili startu obliczeń (przy znajomości warunków początkowych). Bazując na powyższych spostrzeżeniach Gillespie zaproponował w roku 2001 moyfikacje swojego algorytmu zwaną τ-leap [26]. Zakłaa ona omijanie niektórych stanów w trakcie symulacji i estymowanie ilości reakcji jaka w zaszła w pominiętym czasie na postawie rozkłau Poissona. Dokłaność estymacji opiera się na wspomnianych założeniach o niezmienności funkcji skłonności w ukłazie. Oczywiście w miarę wyłużania się skoku, a tym samym ilości reakcji jakie zaszły w mięzyczasie założenie to przestaje być prawziwe, co wynika z faktu, iż wartości funkcji skłonności zależą o liczby reagujących ze sobą cząsteczek. W celu przyspieszenia algorytmu należy zmaksymalizować ługość skoku τ, więc optymalnym rozwiązaniem bęzie znalezienie największego możliwego τ, które w przeziale < t, t + τ > nie powouje znaczącej zmiany żanej z funkcji skłonności w ukłazie. Warunek ten zwany jest przez Gillespiego warunkiem skoku. W skrócie algorytm po moyfikacji τ-leap wygląa następująco: 1. Dla anego ukłau w chwili t znajź czas τ spełniający warunek skoku 2. Korzystając z rozkłaów Poissona wylosuj liczbę reakcji każego typu jaka zaszła w przeziale czasu < t, t + τ > 3. Zmień stan ukłau zgonie ze schematami reakcji, postaw t = t + τ i wróć o kroku 1. Dokłana proceura wyznaczania czasu τ opisana jest w [26]. Warto zauważyć, że jeżeli ilość reagujących molekuł w ukłazie jest niewielka, rzęu kilkunastu, kilkuziesięciu cząsteczek, to każa zmiana ich liczby bęzie miała wpływ na funkcje skłonności, co w skrajnym przypaku prowazi o ługości kroku τ równemu czasowi o zajścia kolejnej

26 26 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych reakcji i algorytm τ-leap staje się równoważny algorytmowi postawowemu. Algorytm Haseltine a i Rawlingsa W roku 2002 Eric Haseltine i James Rawlings zaproponowali swoją moyfikacje postawowego algorytmu Gillespiego [30]. Moyfikacja ta zakłaa pozielenie wszystkich typów reakcji zachozących w ukłazie na wie grupy, tak zwanych reakcji szybkich i reakcji wolnych. Zgonie z prawem ziałania mass tempo reakcji zależy o stężenia reagujących ze sobą substratów, co można rozumieć również tak, iż skłonność (ang. propensity) anej reakcji jest tym większa, im więcej jest cząsteczek substratów tej reakcji. Reakcjami szybkimi są zatem te reakcje, w których liczba reagujących cząsteczek jest barzo uża, rzęu ziesiątek czy setek tysięcy. W takim przypaku ochyłka rzęu kilku, kilkunastu reakcji, które zaszły o czasu t ma niewielki wpływ na wartość funkcji skłonności reakcji w anym czasie. Długość kroku τ o zajścia kolejnej reakcji jest również niewielka, więc można z użą okłanością przybliżyć stochastyczny proces reakcji zależnością eterministyczną wyrażoną równaniem różniczkowym zwyczajnym (ODE). W przypaku reakcji, w których liczba reagentów jest niewielka ich funkcja skłonności również przyjmuje niewielkie wartości, więc reakcje te bęą zachozić wolno, z użymi ostępami τ pomięzy kolejnymi zarzeniami. Powouje to, iż przybliżenie eterministyczne wolnych reakcji obciążone bęzie sporym błęem. Reagujących cząsteczek jest w nich niewiele, rzęu kilku, kilkunastu o kilkuziesięciu, więc ochyłka w ilości okonanych reakcji rzęu kilku-kilkunastu zarzeń ma spory wpływ na wartość funkcji skłonności w anym czasie. Stą też zastosowanie w przypaku tych reakcji przybliżenia za pomocą równań różniczkowych zwyczajnych jest niewskazane. Wykorzystując powyższe spostrzeżenia Haseltine i Rawlings przestawili algorytm, który można w skrócie opisać następująco: 1. Mając any ukła rozziel wszystkie reakcje w nim zachozące na wolne i szybkie. Opisz szybkie reakcje za pomocą ODE 2. Dla anego czasu t oraz anej ilości molekuł przelicz wszystkie funkcje skłonności a µ (t) la wolnych reakcji oraz całkowitą funkcje skłonności M a (t) = a µ (t) (3.32) µ=1 3. Wylosuj wie liczby r 1 i r 2 z rozkłau równomiernego z przeziału < 0, 1 > 4. Rozwiąż ukła ODE la szybkich reakcji o czasu t o czasu t + τ takiego, że: t+τ log(r 1 ) + a (s)s = 0. (3.33) t 5. Wyznacz który typ (µ) wolnych reakcji zajzie w czasie t + τ korzystając z nierówności: µ 1 µ a j (t + τ) r 2 a (t + τ) < a j (t + τ) (3.34) j=1 j=1

27 3.4. ALGORYTMY STOCHASTYCZNE I PRZYBLIŻENIE DETERMINISTYCZNE 27 gzie a j (t+τ) oznacza funkcje skłonności poszczególnych wolnych reakcji, a µ ineks zwycięskiej reakcji. 6. Zmień ilość molekuł zgonie regułami zwycięskiej reakcji µ. Jeżeli nie osiągnięto warunków stopu postaw t = t + τ i wróć o punktu 2 Powyższy algorytm wykorzystałem w rozprawie o przeprowazenia symulacji zbuowanych moeli stochastycznych. Przybliżenie eterministyczne Przybliżenie eterministyczne stworzonych moeli stochastycznych najprościej uzyskać przez zastąpienie opisu stochastycznego równaniami różniczkowymi zwyczajnymi opisującymi zmianę ilości baanych molekuł w czasie. Rozpatrzmy proces proukcji mrna z aktywnego genu. Ilość kopii mrna w chwili t+δt może zwiększyć się na skutek syntezy bąź zmniejszyć na skutek egraacji. Załóżmy, że w anej chwili ukła znajuje się w stanie n oznaczającym ilość kopii mrna. Stan ten może być osiągnięty w wyniku syntezy oatkowej molekuły mrna o ile ukła znajował się wcześniej w stanie n 1 bąź w wyniku egraacji jenej molekuły mrna jeżeli ukła znajował się w stanie n + 1. Stan n ukłau może zostać opuszczony w wyniku syntezy (ukła przejzie o stanu n + 1) bąź egraacji (ukła przejzie o stanu n 1) jak pokazano na rysunku 3.1. Tempo syntezy nie zależy o stanu ukłau i wynosi s s n-1 n n+1 n (n+1) Rysunek 3.1: n - ilość kopii mrna, s - tempo syntezy, - tempo egraacji s, tempo egraacji zależy o stanu ukłau i wyraża się iloczynem współczynnika i ilości kopii mrna w anym stanie (na przykła n la stanu n). Oznaczając przez x n prawopoobieństwo, iż ukła w chwili t znajuje się w stanie n możemy przestawić jego równanie master: t x n = s x n 1 + x n+1 (n + 1) s x n x n n. (3.35) Stacjonarna gęstość prawopoobieństwa powyższego równania wyraża się rozkłaem Poissona o śreniej λ = s/: P = e λ λ n (3.36) n! w rozkłazie Poissona śrenia równa jest wariancji, a więc szum σ zefiniowany jako stosunek ochylenia stanarowego o śreniej wyrazi się zależnością:

28 28 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych σ = λ λ = 1 λ. (3.37) Zgonie z powyższym równaniem szum maleje wraz ze śrenią ilością cząsteczek, więc w przypaku gy śrenia ta jest ostatecznie uża, uzasanione jest przybliżenie eterministyczne wyrażające zmianę ilości cząsteczek mrna w postaci: n = s n, (3.38) t w którego stanie ustalonym ilość cząsteczek n równa jest śreniej λ z rozkłau Poissona. Powyższe spostrzeżenie wykorzystałem w rozprawie o tworzenia przybliżeń eterministycznych. Stacjonarne gęstości prawopoobieństw la barziej skomplikowanych reakcji nie wyrażają się rozkłaem Poissona. Przyjąłem jenak, że wartość szumu w tych reakcjach również maleje wraz ze wzrostem śreniej ilości cząsteczek. Liczba kopii mrna czy białek w stworzonych moelach jest użo większa o jeności, więc takie przybliżenie wyaje się racjonalne. 3.5 Proceura opasowania moelu o anych Buowa moelu wymaga oprócz określenia substratów biorących uział w reakcjach, poania również tempa tych reakcji. Wartości te tworzą zbiór parametrów moelu. Wartości niektórych elementów tego zbioru zostały wyznaczone eksperymentalnie i mogą zostać onalezione w literaturze. Dla części parametrów mogą być znane granice w których powinny się one znajować. Przykłaowo maksymalna wyajność transkrypcji mrna z jenej kopii genu wynosi około 0.16 mrna/s, co wynika z prękości przesuwania się polimerazy RNA po nici DNA wynoszącej 40 nukleotyów (nt) na sekunę oraz minimalnej oległości pomięzy kolejnymi polimerazami wynoszącej 250 nt (v=40/250=0.16) [52]. Poobnie maksymalna wyajność translacji z jenej nici mrna w pojeynczym rybosomie wynosi 15 aminokwasów (a.a.) na sekunę, co przy ziesięciu jenocześnie pracujących na niej rybosomach aje nam 150 a.a. na sekunę. Przyjmując ługość pojeynczego białka na poziomie 300 a.a (przykłaowo białko IκBα u człowieka ma ługość 317 a.a) otrzymujemy maksymalna wyajność translacji z jenej kopii mrna równą 0.5 białka/s [52]. Niestety la większości parametrów nie są znane ani okłane wartości ani też granice w jakich powinny się one znajować i w trakcie buowy moelu parametry te muszą zostać oszacowane. Zmiana ich wartości pociąga za sobą zmiany w zachowaniu się buowanego moelu, więc obiera się je tak, by uzyskana ynamika owzorowywała znane z eksperymentów zachowania ukłau. Możliwe są wa zasanicze poejścia o opasowywania moelu. Pierwsze z nich zakłaa jak najlepsze opasowanie moelu o konkretnego eksperymentu (stosowane mięzy innymi przez grupę Hoffmana), rugie zakłaa takie obranie parametrów, by charakter zachowania moelu przy różnych wymuszeniach zgazał się ze znanymi eksperymentami, przy czym nie musi być on o nich okłanie opasowany. Waą poejścia pierwszego jest to, że moel okłanie opasowany o jenego eksperymentu nie posiaa w ogólnym przypaku zolności generalizacji, to znaczy nie bęzie w stanie w sposób prawiłowy oać zachowania się obserwowanego ukłau przy eksperymentach z innym protokołem wymuszenia bąź wyciszeniem niektórych genów. Moel opasowany weług poejścia rugiego nie oaje okłanie żanego z eksperymentów w sensie stosunków ilościowych, jenak

29 3.5. PROCEDURA DOPASOWANIA MODELU DO DANYCH 29 oaje prawiłowo charakter opowiezi ukłau przy różnych protokołach eksperymentu. Wyniki kolejnych powtórzeń oświaczeń biologicznych różnią się zazwyczaj ilościowo, są jenak zgone jeżeli izie o charakter opowiezi ukłau, więc wyaje się, iż takie poejście jest uzasanione i prowazi o buowy moeli lepiej oających rzeczywistość. Drugie z omówionych tu poejść zostało zastosowane w opasowywaniu moeli stworzonych w ramach rozprawy (moel p53 i moel łączny) jak i moelach Lipniackiego i in. (NF-κB) [56]. W przypaku szukania parametrów moelu eterministycznego, zwłaszcza przy zastosowaniu pierwszego z poejść możliwe jest stworzenie algorytmu znajowania optymalnego opasowania moelu o anych w sensie wskaźnika jakości jak pokazali na przykła Fujarewicz i in. w [21]. Jenakże, jeżeli chcemy uzyskać opasowanie moelu o kilku rożnych eksperymentów, a oatkowo rozważamy moel stochastyczny koniecznym staje się ręczne obranie wartości parametrów. Proceurę opasowywania moeli w ogólnym przypaku rozpoczynano o ich przybliżenia eterministycznego, co wynikało z faktu, że moele opasowywane były częściowo o anych z eksperymentów populacyjnych. Otworzenie ich przez moel stochastyczny wymagałoby wielokrotnego powtórzenia symulacji pojeynczej komórki w celu znalezienia trajektorii oającej śrenie zachowanie populacji komórek, a więc użą czasochłonność. Ponato ponieważ moele stochastyczne buowane były zgonie z postulatem Haseltine a i Rawlingsa, to znaczna część ich równań ODE posiaa okłanie tą samą formę co równania przybliżenia eterministycznego. Po opasowaniu przybliżenia eterministycznego przyjmowano wartości jego parametrów jako wyjściowe o ostrojenia w moelu stochastycznym. Zastosowany algorytm opasowywania można w sposób uproszczony przestawić w następujących krokach: 1. Przyjmij rozsąne w rozumieniu intuicyjnym wartości wyjściowe parametrów przybliżenia eterministycznego. 2. Znajź parametry przybliżenia eterministycznego najlepiej oające wszystkie z ostępnych wyników eksperymentów. 3. Wykorzystując wielkości parametrów znalezione w punkcie 2 jako wyjściowe la moelu stochastycznego znajź ich najlepsze ostrojenie w sensie jakościowego oania wyników wszystkich ostępnych eksperymentów. W zaproponowanych moelach występują sprzężenia zwrotne, a moele opasowywano o kilku eksperymentów równocześnie, więc kroki 2 i 3 posiaają charakter iteracyjny. Zaprezentowane poejście pomimo, że czasochłonne pozwala na uzyskanie barziej uniwersalnych moeli w rozumieniu ich zolności o generalizacji.

30 30 Deterministyczne i stochastyczne moelowanie ścieżek regulatorowych

31 Rozział 4 Istniejące moele ścieżki sygnałowej NF-κB 4.1 Streszczenie Czynnik transkrypcyjny NF-κB reguluje wczesną opowieź immunologiczna przez przekazanie informacji o pobuzeniu patogenami czy cyklinami o jąra komórkowego powoując opowieź w postaci zmian ekspresji opowienich genów. Rozział czwarty poświęcony jest istniejącym w literaturze moelom ścieżki sygnałowej NF-κB ze szczególnym uwzglęnieniem moelu zaproponowanego przez Tomasza Lipniackiego i współpracowników. w roku 2007 [56]. Moel ten, rozwijany o 2004 roku, w oróżnieniu o reszty moeli, jest rozwiązaniem stochastycznym umożliwiającym symulacje zachowania się pojeynczych komórek. Zawiera on wie pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego. Pierwsza z nich wiąże czynnik transkrypcyjny z jego inhibitorem IκBα i w przypaku zaistnienia wymuszenia powouje powstawanie w ukłazie oscylacji. Druga pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego prowaząca przez A20 jest nowym rozwiązaniem wprowazonym przez autorów. Działanie tej pętli polega na utrwalaniu oscylacji proukowanych przez pętle pierwszą. Jak pokazuje eksperyment Lee i in. [51] brak rugiego sprzężenia zwrotnego prowazi o zaniku oscylacji w moule NF-κB. Rozwiązania powstałe prze moelem [56], na przykła proponowane grupę Hoffmanna i Levchenki [34], nie posiaały sprzężenia poprzez A20 i skupiały się na interakcji trzech form białka IκB. Powyższa cecha jak i brak bałości o zolność o generalizacji, sprawiają, iż moele te nie są w stanie w sposób prawiłowy oać zachowania się komórki przy rożnych protokołach wymuszenia i blokazie A20. Opracowany przez Lipniackiego i in. [56] moel stał się postawą o buowy moelu łącznego ścieżek NF-κB i p53 przestawionego w rozziale siómym. Moele Lipniackiego i in. oraz zespołu Hoffmanna-Levchenki stanowią wie główne grupy moeli moułu NF-κB spotykane w literaturze i one zostaną omówione w rozziale czwartym. Drugi porozział zawiera opis moeli opracowanych przez grupę Hoffmanna- Levchenki, porozział trzeci opis wóch wersji moeli Lipniackiego i in. z roku 2004 i W czwartej części rozziału czwartego omówiłem szczegółowo buowę moelu Lipniackiego i in. z roku 2007, w porozziale piątym przestawiono rezultaty jego symulacji.

32 32 Istniejące moele ścieżki sygnałowej NF-κB 4.2 Moele grupy Hoffmana Moele ścieżki sygnałowej NF-κB proponowane przez grupę Hoffmanna-Levchenki, o której należą mięzy innymi Cheong, Kearns i Werner są moelami eterministycznymi. Moel Hoffmanna-Levchenki zaproponowany został po raz pierwszy w roku 2002 [34] w celu wyjaśnienia obserwowanych w eksperymentach oscylacji w poziomach NF-κB występujących po pobuzeniu jego ścieżki sygnałowej. Zawierał on białko IKK, czynnik transkrypcyjny NF-κB (rysunek 4.1) oraz trzy formy białka IκB (α, β, ɛ) bęące inhibitorem NF-κB. Rysunek 4.1: Moel ścieżki sygnałowej NF-κB grupy Hoffmanna-Levchenki z roku 2002 [34]. Występują w nim 3 formy IκB, brak sprzężenia o A20. Wymuszenie poawane jest za pomocą profilu IKK. Przy braku pobuzenia NF-κB znajuje się w cytoplazmie uwięzione w kompleksie z IκB. W wyniku pobuzenia na przykła przez TNFα w komórce pojawia się aktywne białko IKK. W moelu [34] pominięto część ścieżki znajująca się pomięzy receptorami wychwytującymi TNFα, a białkiem IKK przyjmując pojawienie się aktywnego IKK jako wejście o ukłau. Aktywne białko IKK fosforyluje cząsteczki IκB zarówno swobone jak i te w kompleksie z NF-κB, co prowazi o ich rozpau. Uwolnione w ten sposób białko NF-κB przeostaje się o jąra, gzie pełni rolę czynnika transkrypcyjnego la wszystkich trzech form swego inhibitora. Po procesie transkrypcji IκB mrna ulega translacji w cytoplazmie i wraca o jąra komórkowego gzie przyczepia się o NF-κB wypychając je o cytoplazmy. Sprzężenie pomięzy NF-κB, a wszystkimi trzema formami IκB pełni w ukłazie rolę ujemnego sprzężenia zwrotnego, co razem z opóźnieniem wynikającym z transkrypcji i translacji IκB prowazi o pojawienia się oscylacji w przypaku ciągłego wymuszenia. Powyższy moel stał się postawą la pojawiających się w literaturze kolejnych moeli ścieżki sygnałowej NF-κB. Wszystkie one zawierają w sobie element oscylacyjny oparty o