Transkrypt

1 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA TOM NR 2 ( ) LIGAZY UBIKWITYNOWO-BIA KOWE W SZLAKACH SYGNA OWYCH AUKSYN, JASMONIANÓW I GIBERELIN* UBIQUITIN LIGASES INVOLVED IN AUXIN, JASMONATE AND GIBBERELLIN SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS Katarzyna MARCINIAK, Tomasz TUROWSKI, Emilia WILMOWICZ, Kamil FRANKOWSKI, Jacek KÊSY, Jan KOPCEWICZ Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Wydzia³ Biologii i Nauk o Ziemi, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Zak³ad Fizjologii i Biologii Molekularnej Roœlin Streszczenie: Realizacja wewnêtrznego programu genetycznego, która prowadzi do powstania organizmu roœliny, wymaga skorelowania przebiegu endogennych procesów wzrostu i rozwoju z ró nymi bodÿcami œrodowiskowymi. Zasadnicz¹ rolê w tym procesie odgrywaj¹ regulatory wzrostu i rozwoju nazywane hormonami roœlinnymi lub fitohormonami. Zgodnie z definicj¹, hormony roœlinne s¹ cz¹steczkami sygna- ³owymi wytwarzanymi przez roœlinê w bardzo niskich stê eniach. Syntetyzowane w jednych czêœciach organizmu, przemieszczaj¹ siê do innych czêœci przez system wi¹zek przewodz¹cych lub, jak ma to miejsce przynajmniej w przypadku auksyn, dziêki skomplikowanemu systemowi bezpoœredniego transportu z komórki do komórki. Fitohormony dzia³aj¹ na specyficzne tkanki docelowe, chocia inaczej ni u zwierz¹t odpowiedzi s¹ czêsto efektem dzia³ania dwóch lub wiêkszej liczby hormonów. Kluczowym w poznaniu hormonalnej kontroli wzrostu i rozwoju roœlin jest zrozumienie mechanizmów ich percepcji i szlaków przekazywania sygna³u. Pomimo wielu lat badañ, dopiero niedawno uda³o siê zidentyfikowaæ receptory niektórych z fitohormonów, co niew¹tpliwie spowodowa³o znaczny postêp w rozumieniu przez fizjologów funkcjonowania tych substancji u roœlin. Badania ujawni³y równie zupe³nie nowy mechanizm sygnalizacji wewn¹trzkomórkowej, w którym rolê receptorów pe³ni¹ ligazy ubikwitynowobia³kowe. Bia³ka te funkcjonuj¹ jako sk³adnik systemu ubikwitynowo-proteasomalnego (UPS), który poprzez selektywn¹ hydrolizê bia³ek regulatorowych uczestniczy w kontroli przekazywania sygna³ów w komórkach eukariontów. Ligazy ubikwitynowo-bia³kowe E3 specyficznie wi¹ ¹ bia³kowe substraty i poœrednicz¹ w ich ubikwitylacji, a nastêpnie degradacji w proteasomie 26S. W genomie Arabidopsis thaliana wystêpuje oko³o 1400 genów koduj¹cych poszczególne elementy UPS, z czego oko³o 90% genów koduje ligazy E3, obejmuj¹ce du ¹ rodzinê bia³ek lub kompleksów bia³kowych zawieraj¹cych w swej budowie charakterystyczne domeny RING-finger, U-box lub HECT. Analiza sekwencji nukleotydowych ujawni³a, e sk³adniki UPS wykazuj¹ du ¹ zachowawczoœæ w obrêbie ró nych gatunków królestwa roœlin. Spoœród wszystkich ligaz ubikwitynowo-bia³kowych wystêpuj¹cych u roœlin najlepiej zba- *Praca powsta³a dziêki wsparciu finansowemu grantu MNiSW nr N N oraz stypendium marsza³ka województwa kujawsko-pomorskiego "Stypendia dla doktorantów 2008/ ZPORR" nr SPS.IV-3040-UE/619/2009

2 410 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ dane zosta³y te nale ¹ce do klasy SCF, której skrót pochodzi od nazw trzech podjednostek: SKP1, kuliny (ang. cullin) i bia³ka z kaset¹ F FBP (ang. F-box protein). Bia³ka z kaset¹ F stanowi¹ najwiêksz¹ rodzinê bia³ek A. thaliana i kodowane s¹ przez 2,7% genomu tej roœliny. Odkrycia ostatnich lat wykaza³y, e roœlinne bia³ka AtTIR1 (ang. A. thaliana Transport Inhibitor Response 1), OsGID1 (ang. O. sativa Gibberellin Insensitive Dwarf 1) oraz AtCOI1 (ang. A. thaliana CORonatine Insensitive 1), pe³ni¹ce podstawow¹ rolê w mechanizmach dzia³ania odpowiednio auksyn, giberelin i kwasu jasmonowego, s¹ bia³kami FBP (AtTIR1 i AtCOI) lub blisko z nimi wspó³dzia³aj¹ (OsGID1), natomiast zadaniem ca³ych kompleksów SCF jest poœredniczenie w degradacji represorów odpowiedzi na hormony. W przypadku auksyn, reakcje na hormon s¹ zablokowane przez bia³ka AUX/IAA tworz¹ce heterodimery z bia³kami ARF, które s¹ z kolei aktywatorami transkrypcji genów odpowiedzi na auksyny. Przy wysokim stê eniu auksyn, hormon wi¹ e siê z bia³kiem TIR1, co umo liwia równie zwi¹zanie AUX/IAA z kompleksem SCF, a nastêpnie ubikwitylacjê i degradacjê represorów w proteasomie 26S. W konsekwencji tego dochodzi do odblokowania czynników transkrypcyjnych ARF. W przypadku jasmonianów, odpowiedzi na hormon blokowane s¹ przez bia³ka JAZ, które wi¹ ¹ siê z czynnikami transkrypcyjnymi MYC2. Pod wp³ywem JA nastêpuje aktywacja kompleksu ligazy ubikwityny SCF COI1, która znakuje bia³ka JAZ i skierowuje je do degradacji, przez co odblokowuje aktywatory transkrypcji MYC2. Oprócz auksyn i jasmonianów równie gibereliny s¹ hormonami, w percepcjê których zaanga owany jest kompleks ligazy ubikwityny typu SCF. Dzia³anie GA blokowane jest przez bia³ka DELLA, które wi¹ ¹ bia³ka GAMyb, PIF3, PIF4 oraz prawdopodobnie inne czynniki transkrypcyjne kontroluj¹ce ekspresjê genów odpowiedzi na gibereliny. Bia³ka DELLA s¹ równie aktywatorami ekspresji niektórych genów regulowanych przez gibereliny. Wœród nich s¹ geny koduj¹ce enzymy biosyntezy giberelin i niektóre sk³adniki ich szlaków sygna³owych, w³¹cznie z receptorem GID1. Pod wp³ywem giberelin receptor GID1 oddzia³uje z DELLA, a nastêpnie wytworzony kompleks GA-GID1-DELLA rozpoznawany jest przez ligazê ubikwitynowo-bia³kow¹ SCF GID2/SLY1, która znakuje bia³ka represorowe do degradacji. W tym przypadku hormon nie jest wi¹zany bezpoœrednio przez bia³ko FBP, ale uczestniczy w tym dodatkowa cz¹steczka podjednostki receptorowej kompleksu SCF. Z uwagi na wa noœæ kompleksu ligazy ubikwitynowo-bia³kowej w przekazywaniu sygna³u, oczywiste jest, e proces jej tworzenia i funkcjonowania jest œciœle regulowany. Uczestnicz¹ w tym trzy bia³ka lub kompleksy bia³kowe, tj. bia³ko RUB1 (ang. Related to UBiquitin 1) i CAND1 (ang. Cullin Associated Neddylation Dissociated 1) oraz sygna³osom COP9 (CSN). Przedstawiony w pracy mechanizm przekazywania sygna³ów hormonalnych zosta³ jak dot¹d opisany jedynie u roœlin, jednak ze wzglêdu na powszechne wystêpowanie ligaz ubikwitynowo-bia³kowych w komórkach eukariotycznych, nie jest wykluczone, e ten nowy mechanizm mo e wystêpowaæ tak e u innych organizmów. S³owa kluczowe: hormony roœlinne, ligazy ubikwitynowe, percepcja i transdukcja sygna³u. Summary: Plant growth and development, which determinate plant form, require the integration of a variety of environmental signals with the intrinsic genetic program. Fundamental to this process are several growth regulators called the plant hormones or phytohormones. In accordance with definition, the plant hormones are signal molecules produced within the plant and occur in extremely low concentrations. They are often synthesized in one part of the plant and are transported to another location through the plant vasculature system or, at least in the case of auxin, through a complex cell-to-cell transport system. They interact with specific target tissues to cause physiological responses and unlikely to animals responses are often the result of two or more hormones acting together. Central to comprehending hormonal control of plant growth and development is the understanding of how the hormones are perceived and the signal is transduced. Despite decades of study, only recently receptors for several of these substances have been identified, providing plant physiologists with a much clearer picture of hormonal control. Moreover, studies have revealed a quite novel model of signal transduction in which ubiquitin ligases function as hormone receptors. In eukaryotes, ubiquitin ligases operate in the ubiquitin-proteasome system (UPS) participating in the control of signal transduction events by selectively eliminating regulatory proteins. E3 ubiquitin ligases specifically bind degradation substrates and mediate their polyubiquitylation and later degradation by the 26S proteasome. In Arabidopsis thaliana more than 1400 genes encode components of the UPS. About 90% of these genes encode subunits of the E3 ubiquitin ligases comprise large family of protein or protein complexes containing a RING-finger, U-box domain or a HECT domain. Analysis of nucleotide sequences have revealed also that the UPS is strongly conse-

3 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 411 rved in plants kingdom. The most thoroughly studied in plants is the SCF class of E3 ubiquitin ligases. The name of this class is derived from three of its four subunits: SKP1, cullin and the F-box protein (FBP). FBP represent the largest superfamily in Arabidopsis, comprising 2,7% of this plant genome. The recent study revealed that plant proteins: AtTIR1 (A. thaliana Transport Inhibitor Response 1), OsGID1 (O. sativa Gibberellin Insensitive Dwarf 1) and AtCOI1 (A. thaliana CORonatine Insensitive 1), which play important role respectively in auxin, jasmonate and gibberellin signal transduction, are F-box proteins (AtTIR1, AtCOI1) or closely related (OsGID1), whereas the role of the SCF is to degrade repressors of hormone response. In the case of auxin, auxin-responsive genes are repressed by AUX/IAA proteins heterodimerizing with ARF transcription factors. Upon an auxin stimulus, the TIR1 binds auxin, enabling the recruitment of AUX/IAA proteins to the SCF complex for ubiquitination. Subsequently, AUX/IAA degradation by the 26S proteasome derepresses the ARF transcription factors. In the case of jasmonate, JAZ proteins negatively regulate jasmonate response by repressing MYC2 transcriptional activity. After binding of jasmonate, the SCF COI1 ubiquitin-ligase targets JAZ proteins for ubiquitin-mediated proteolysis, derepressing MYC2. In addition to auxin and jasmonate, gibberellin is yet another plant hormone whose perception involves an SCF ubiquitin ligase complex. DELLA proteins repress GA response by negatively regulating GAMyb, PIF3, PIF4, and presumably other transcription factors that control the expression of GA-inducible genes. DELLA proteins also promote the expression of several GA-repressible genes, some of which encode GA biosynthetic enzymes and components of the response pathway including the GID1 receptors. In the consequence of GA binding, the GID1 receptor interacts with DELLA and the new created complex (GA-GID1-DELLA) is recognized by the SCF GID2/SLY1 ubiquitinligase, which targets DELLA for ubiquitin-mediated degradation. It is seen, that GAs is not directly sensed by an F-box protein but instead by an extension molecule of the SCF substrate receptor subunit. Given the importance of SCFs to signal transduction, it is not surprising that SCF assembly and function are highly regulated. So far, tree proteins or protein complexes have been implicated in SCF regulation: RUB1 (Related to UBiquitin 1), CAND1 (Cullin Associated Neddylation Dissociated 1) and the COP9 signalosome (CSN). The mechanism of hormonal signal transduction, presented in this paper has been described only in plants, however, due to extensive occurrence of ubiquitin ligases in eukaryotic cells, it can be supposed, that this novel hormone-signaling mechanism may also exist in other organisms. Key words: plant hormones, ubiquitin ligases, signal perception and transduction. 1. WSTÊP Hormony to substancje chemiczne koordynuj¹ce procesy yciowe zachodz¹ce w ró nych komórkach organizmów wielokomórkowych [2]. Zarówno u zwierz¹t, jak i u roœlin syntetyzowane zazwyczaj w jednych czêœciach organizmu, przemieszczaj¹ siê do innych, gdzie wp³ywaj¹ na przebieg procesów wzrostu i rozwoju. Wyniki prowadzonych od dziesiêcioleci badañ fizjologicznych wykazywa³y plejotropowoœæ dzia³ania hormonów roœlinnych (fitohormonów), co w œwiadomoœci wielu fizjologów roœlin wytworzy³o przekonanie o ich niespecyficznoœci. W miarê poznawania molekularnych mechanizmów funkcjonowania fitohormonów staje siê jasne, e dzia³anie ka dego z nich jest jednak specyficzne, czego podstaw¹ s¹ odrêbne receptory i zwi¹zane z nimi szlaki sygna³owe. Przyczyn¹ obserwowanych efektów plejotropowych s¹ liczne interakcje, do jakich dochodzi pomiêdzy szlakami przekazywania sygna³ów poszczególnych fitohormonów. Percepcja, a nastêpnie transdukcja sygna³u okreœlonego hormonu prowadzi czêsto do aktywacji b¹dÿ represji charakterystycznego zestawu bia³ek i/lub genów, wœród których znajduj¹ siê bia³ka i geny zwi¹zane z metabolizmem i szlakami sygna³owymi innych fitohormonów. Charakterystyczne dla hormonów roœlinnych jest równie to, e obiekty docelowe

4 412 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ ich dzia³ania mog¹ byæ inne w zale noœci od stê enia u ytego hormonu, rodzaju tkanki i fazy rozwojowej roœliny. Mo na jednak wskazaæ wiele reakcji roœlin na fitohormony wykazuj¹cych du ¹ specyficznoœæ, choæby stymulacja przez gibereliny ekspresji genów enzymów amylolitycznych w komórkach warstwy aleuronowej ziarniaków zbó lub stymulacja przez auksyny genów, których bia³kowe produkty odpowiedzialne s¹ za biosyntezê etylenu [18, 72]. Mechanizmy dzia³ania poszczególnych fitohormonów zosta³y ju w znacznej mierze opisane w polskich kwartalnikach [6, 37, 38, 41, 53, 69, 80], istnieje jednak potrzeba uwzglêdnienia najnowszych doniesieñ oraz dokonania pewnego podsumowania w tej dziedzinie. W niniejszej pracy chcielibyœmy zwróciæ uwagê Czytelnika na fakt, e poza oczywist¹ ró nic¹ w naturze hormonów roœlinnych i zwierzêcych, dosyæ odmienne s¹ tak e ich szlaki sygna³owe. U zwierz¹t tworz¹ je przede wszystkim kinazy bia³kowe i wtórne przekaÿniki, jak, np. cykliczne nukleotydy, trójfosforan inozytolu czy diacyloglicerol. U roœlin natomiast, w przypadku trzech spoœród siedmiu najbardziej znanych hormonów, istot¹ dzia³ania szlaku sygnalizacyjnego, oprócz wtórnych przekaÿników, kinaz i fosfataz, jest aktywacja ligaz ubikwitynowo-bia³kowych. Sytuacja taka ma miejsce w przypadku auksyn, jasmonianów oraz giberelin. Pojawienie siê fitohormonu prowadzi do aktywacji odpowiedniej ligazy i w konsekwencji do uruchomienia procesu proteolitycznej degradacji bia³ek represorowych uczestnicz¹cych w regulacji aktywnoœci genów odpowiedzi na te hormony. 2. LIGAZY UBIKWITYNOWO-BIA KOWE W SZLAKACH SYGNA OWYCH AUKSYN, JASMONIANÓW I GIBERELIN W komórkach eukariontów wystêpuj¹ dwa podstawowe systemy degradacyjne bia³ek lizosomalny oraz ubikwitynowo-proteasomalny UPS (ang. Ubiquitin-26S Proteasome System) [21]. Szlak ubikwitynowo-proteasomalny, którego istot¹ jest RYCINA 1. Szlak ubikwitylacji bia³ek (szczegó³y w tekœcie) FIGURE 1. The protein ubiquitilation pathway (for details see text)

5 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 413 zdolnoœæ do selektywnego wybierania bia³ek przeznaczonych do hydrolizy, odpowiedzialny jest w komórce za degradacjê licznych bia³ek regulatorowych. W genomie Arabidopsis thaliana wystêpuje oko³o 1400 genów koduj¹cych poszczególne elementy UPS, z czego oko³o 90% genów koduje monomeryczne lub polimeryczne ligazy ubikwitynowo-bia³kowe E3 [49]. G³ówn¹ funkcj¹ ligaz jest rozpoznawanie i wi¹zanie bia³kowego substratu oraz przeniesienie na niego bia³ka znacznikowego ubikwityny (Ub) (ryc. 1). Przy³¹czenie ubikwityny do bia³ka substratowego poprzedzone jest reakcj¹ aktywacji ubikwityny katalizowan¹ przez enzym aktywuj¹cy E1. W pierwszym etapie dochodzi do utworzenia ubikwityloadenylanu (Ub-AMP), a nastêpnie powstaje wysokoenergetyczne wi¹zanie tioestrowe pomiêdzy ubikwityn¹ a reszt¹ cysteiny w centrum katalitycznym enzymu E1. Zaktywowana w ten sposób ubikwityna zostaje przeniesiona na resztê cysteiny w enzymie koniuguj¹cym E2, sk¹d ligaza ubikwitynowobia³kowa E3 przenosi j¹ na bia³kowy substrat. Proces ten powtarza siê kilkakrotnie, a zostanie utworzony ³añcuch poliubikwitynowy. Wyznakowane polipeptydy s¹ nastêpnie degradowane w proteasomach [36, 61]. RYCINA 2. Budowa i regulacja aktywnoœci ligazy E3 typu SCF: (A) nieaktywna ligaza; (B) tworzenie funkcjonalnego kompleksu ligazy; (C) aktywna ligaza; (D) deaktywacja ligazy (za [21, 54] zmodyfikowane, szczegó³y w tekœcie) FIGURE 2. The structure and the regulation of E3 SCF ligase activity: (A) inactive ligase; (B) formation of functional ligase complex; (C) active ligase; (D) inactivation of ligase (according to [21, 54] modified, for details see text)

6 414 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ Roœlinne ligazy E3 tworz¹ du ¹ rodzinê bia³ek lub kompleksów bia³kowych z charakterystycznymi domenami RING-finger (ang. Really Interesting New Gene), HECT (ang. Homologous to the E6-AP C-Terminus) lub U-box [61]. Najwa niejsze, z punktu widzenia regulacji szlaków przekazywania sygna³ów hormonalnych, s¹ jednak wspomniane ligazy ubikwityny E3 typu SCF (ang. SKP1- Cullin-F-box-RBX1) (ryc. 2). S¹ to kompleksy bia³kowe zbudowane z co najmniej 4 podjednostek. Rdzeñ ligazy tworzy kulina i bia³ko RBX1/ROC1 (ang. Ring BoX protein 1/Regulator Of Cullins 1) natomiast bia³ka SKP1/ASK1 (ang. S-phase Kinase associated Protein 1/Arabidopsis SKP 1-related) oraz FBP (ang. F-Box Protein) stanowi¹ wymienne elementy kompleksu. Bia³ka FBP, zawieraj¹ce charakterystyczn¹ domenê F, decyduj¹ o swoistoœci wi¹zania substratów przeznaczonych do degradacji i s¹ najliczniejsz¹ rodzin¹ bia³ek rzodkiewnika (jest ich ponad 700, co stanowi 2,7% wszystkich bia³ek kodowanych przez genom) [26]. Tworzenie aktywnej ligazy E3 typu SCF rozpoczyna siê od przy³¹czenia do nieaktywnego kompleksu CUL1-RBX1-CAND1 wielopodjednostkowego kompleksu COP9/CSN (ang. COnstitutive Photomorphogenic 9/COP9 Signalosome) z jednoczesnym od³¹czeniem bia³ka CAND1 (ang. Cullin-Associated and Neddylation- Dissociated 1) (ryc. 2). Nastêpnie do kuliny przy³¹cza siê bia³ko RUB1 (ang. Related to UBiquitin 1 u zwierz¹t NEDD8), co powoduje jej modyfikacjê i w konsekwencji do³¹czenie podjednostki SKP1/ASK1 oraz bia³ka FBP wraz z substratem maj¹cym ulec ubikwitylacji. Bia³ko CAND1 wspó³zawodniczy z podjednostk¹ SKP1/ASK1 o wi¹zanie z kulin¹, ale tylko wówczas, gdy nie jest ona po³¹czona z bia³kiem RUB1/ NEDD8 [79]. Zbudowany z oœmiu polipeptydów kompleks bia³kowy COP9/CSN jest niezbêdny w przebiegu procesu ubikwitylacji substratu. Wykazano jednak, e uczestniczy on równie w reakcji derubinylacji/denedylacji kuliny, hamuj¹c w ten sposób aktywnoœæ ligazy SCF. Przy³¹czanie do kuliny bia³ka RUB1 (zwane rubinylacj¹), jest reakcj¹ trójstopniow¹. Bior¹ w niej udzia³ enzymy analogiczne do E1 i E2 uczestnicz¹ce w aktywacji i koniugacji ubikwityny oraz ligaza, któr¹ jest bia³ko RBX1 bêd¹ce podjednostk¹ kompleksu ligazy SCF [27]. Odkrycia ostatnich lat wykaza³y, e roœlinne bia³ka AtTIR1 (ang. A. thaliana Transport Inhibitor Response 1) [35], OsGID1 (ang. O. sativa Gibberellin Insensitive Dwarf 1) [66] oraz AtCOI1 (ang. A. thaliana COronatine Insensitive 1) [34], pe³ni¹ce podstawow¹ rolê w odpowiedzi roœlin na auksyny, gibereliny i kwas jasmonowy, s¹ bia³kami FBP (TIR1 i COI) lub blisko z nimi wspó³dzia³aj¹ (GID1) Auksyny Auksyny s¹ podstawowymi fitohormonami odpowiedzialnymi za prawid³owy przebieg embriogenezy, stymulacjê podzia³ów komórek i ich wzrost na d³ugoœæ, kontrolê morfogenezy tkanek i ca³ych organów, dominacjê wierzcho³kow¹, jak i odpowiedzi tropiczne. Najwa niejsz¹ naturaln¹ auksyn¹ jest kwas indolilo-3-octowy IAA (ang. Indole-3-Acetic Acid) [55, 74]. Badania nad molekularnymi mechanizmami dzia³ania auksyn rozpoczê³y siê na pocz¹tku lat 70. ubieg³ego stulecia wykryciem bia³ka ABP1 (ang. Auxin Binding

7 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 415 Protein 1), charakteryzuj¹cego siê wysokim powinowactwem i specyficznoœci¹ wzglêdem auksyn oraz uczestnictwem w indukowanych przez ten hormon odpowiedziach komórkowych zachodz¹cych w obrêbie b³ony plazmatycznej. ABP1 zosta³ uznany za receptor b³onowy auksyn, jednak mimo up³ywu blisko 40 lat od jego odkrycia funkcja, jak¹ pe³ni, nie jest do koñca zrozumia³a. Powodem tego jest niejasna lokalizacja subkomórkowa ABP1, brak jednoznacznie okreœlonych dalszych elementów szlaku sygna³owego zwi¹zanego z tym bia³kiem, a tak e trudnoœæ w wykazaniu udzia³u tego receptora w regulacji ekspresji genów odpowiedzi na auksynê [53] Czynniki odpowiedzi auksynowych ARF i bia³ka represorowe AUX/IAA Traktowanie roœlin auksyn¹, poza pewnymi zmianami na poziomie b³on, prowadzi do wzrostu ekspresji specyficznych genów (tab. 1). Wœród nich do najlepiej scharakteryzowanych nale ¹ 3 rodziny: AUX/ IAA (ang. AUXin/Indole-3-Acetic Acid), SAUR (ang. Small Auxin Up RNA) i GH3, a tak e geny koduj¹ce syntazy ACC [55]. Promotory pierwotnych genów odpowiedzi na auksynê zawieraj¹ charakterystyczn¹ sekwencjê nukleotydow¹ TGTCTC nazwan¹ AuxRE (ang. Auxin Responsive Element). Poznanie tej sekwencji pozwoli³o na identyfikacjê w komórkach A. thaliana czynników transkrypcyjnych ARF (ang. Auxin Response Factors) reguluj¹cych aktywnoœæ genów odpowiedzi na auksynê. W genomie A. thaliana odkryto 23 geny ARF, z czego jeden ARF23 jest pseudogenem. Bia³kowe produkty tych genów wi¹ ¹ siê z AuxRE za poœrednictwem znajduj¹cej siê na N- koñcu domeny DBD (ang. DNA Binding Domain) (ryc. 3A). Sk³ada siê ona z ok. 350 aminokwasów i zawiera w swej centralnej czêœci motyw B3 wystêpuj¹cy tak e w innych roœlinnych czynnikach transkrypcyjnych, takich jak: ABI3, FUSCA3, RAV1 i RAV2. W bia³kach TABELA 1. Wybrane geny wczesnej odpowiedzi na auksynê TABLE 1. Selected early auxin response genes Geny Gatunek roœliny Czas odp. na IAA (min) 1. Rodzina genów AUX/IAA GmAUX22 Glycine max 15 GmAUX28 (soja zwyczajna) 30 GH1 15 PS-IAA4-5 Pisum sativum 5 PS-IAA6 (groch zwyczajny) 8 ARG3 Vigna radiata 20 ARG4 (fasola mung) 20 AtAUX2-11 (IAA4) Arabidopsis thaliana 30 AtAUX2-27 (IAA5) (rzodkiewnik 90 pospolity) IAA1-IAA IAA7, IAA IAA9-IAA Rodzina genów SAUR SAURs ARG7 SAUR-AC1 3. Rodzina genów GH3 Glycine max 3 5 Vigna radiata 5 A rabidopsis thaliana GH3 Glycine max 5 4. Geny koduj¹ce syntazy ACC ACS4 CmACS2 OsACS1 Arabidopsis thaliana 25 Cucurbita maxima (dynia olbrzymia) Oryza sativa (ry siewny) 20

8 416 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ RYCINA 3. Budowa czynników odpowiedzi auksynowych ARF (A) i bia³ek represorowych AUX/IAA (B) A. thaliana: DBD domena wi¹ ¹ca DNA (kolorem ciemnoniebieskim zaznaczono dodatkowe aminokwasy); MR domena regulatorowa (AD aktywuj¹ca, RD represorowa); CTD domena odpowiedzialna za dimeryzacjê bia³ek ARF. QSL, SPL, SL/G, S domeny bogate w glutaminê (Q), serynê (S), leucynê (L), prolinê (P) lub glicynê (G) (za [22] zmodyfikowane, szczegó³y w tekœcie) FIGURE 3. The structure of auxin response factors ARF (A) and repressor proteins AUX/IAA (B) in A. thaliana: DBD DNA-binding domain (with the dark-blue color additional amino acids were depicted); MR regulatory domain (AD activating, RD repressing); CTD dimerization domain; QSL, SPL, SL/G, S glutamine (Q), serine (S), leucine (L), proline (P) or glycine (G) rich domain (according to [22], modified, for details see text) ARF10, 16 i 17 domena DBD zawiera dodatkowo reszt aminokwasowych, a w przypadku ARF23 jest niepe³nej d³ugoœci. C-koniec wiêkszoœci bia³ek ARF zawiera domenê CTD (ang. Carboxy-Terminal Dimerization domain) z dwoma charakterystycznymi motywami III i IV, odpowiedzialnymi za dimeryzacjê [22]. W œrodkowej czêœci ARF wystêpuje zmienna domena MR (ang. Middle Region). W ró nych bia³kach ARF region ten mo e dzia³aæ jako domena aktywuj¹ca AD (ang. Activation Domain) lub jako domena represorowa RD (ang. Repression Domain). Domena AD bogata jest w reszty glutaminy, seryny i leucyny, natomiast domena RD w reszty seryny oraz w niektórych przypadkach w reszty proliny, leucyny i/lub glicyny. Bia³ka ARF5-8 i ARF19 funkcjonuj¹ jako aktywatory transkrypcji wczesnych genów odpowiedzi na auksyny, natomiast przyjmuje siê, e pozosta³e bia³ka ARF dzia³aj¹ jako represory transkrypcji, choæ potwierdzone to

9 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 417 zosta³o jedynie w przypadku ARF2-4 i 9. Ekspresja genów ARF zachodzi we wszystkich dojrza³ych organach i w wiêkszoœci przypadków nie jest regulowana przez auksyny [71] natomiast wiadomo, e poziom co najmniej piêciu transkryptów ARF u rzodkiewnika jest regulowany przez microrna [14]. Bia³ka ARF mog¹ wi¹zaæ siê do sekwencji AuxRE jako monomery, homodimery, heterodimery z innymi bia³kami ARF lub jako heterodimery z bia³kami AUX/IAA. Kontrola aktywnoœci bia³ek ARF zachodzi poprzez interakcje z bia³kami AUX/IAA. Aktywnoœæ tych ostatnich regulowana jest przez proteolityczn¹ degradacjê z udzia³em UPS. Istotne znaczenie w tym procesie odgrywa ligaza ubikwityny SCF TIR1. U A. thaliana wystêpuje 29 bia³ek AUX/IAA, natomiast u ry u 31 bia³ek i wiêkszoœæ z nich zawiera cztery konserwatywne domeny oznaczane numerami I IV [29, 42]. Wystêpuj¹ce na C-koñcu domeny III i IV wykazuj¹ znaczne podobieñstwo do domen III i IV obecnych w bia³kach ARF (ryc. 3B) oraz odpowiedzialne s¹ za oddzia³ywania pomiêdzy AUX/IAA-ARF. Heterodimery AUX/IAA-ARF hamuj¹ aktywnoœæ transkrypcyjn¹ pierwotnych genów odpowiedzi na auksyny. Przypuszcza siê, e w procesie represji aktywnie uczestniczy tak e domena I bia³ek AUX/IAA zawieraj¹ca motyw LxLxL [42], który oddzia³uje z korepresorem TPL (ang. TOPLESS), co najmniej w przypadku IAA12/BDL (ang. IAA12/BODENLOS) [62]. Utworzona przez 13 reszt aminokwasowych domena II bia³ek AUX/IAA oznaczana jako DEGRON decyduje o ich stabilnoœci. Dziêki niej dochodzi do po³¹czenia z bia³kiem TIR1 (ang. Transport Inhibitor Response 1) wchodz¹cym w sk³ad ligazy ubikwitynowej SCF TIR odpowiedzialnej za znakowanie do degradacji [56] Wi¹zanie bia³ek represorowych do kompleksu ligazy SCF TIR1 Odpowiedzialne za specyficzne wi¹zanie AUX/IAA do kompleksu ligazy bia³ko TIR1, zosta³o zidentyfikowane oko³o 10 lat temu. Dopiero niedawno jednak odkryto, e odgrywa ono wyj¹tkow¹ rolê w mechanizmie funkcjonowania auksyn. Okaza³o siê, e TIR1 ma zdolnoœæ wi¹zania auksyn, co wp³ywa bezpoœrednio na tworzenie kompleksu TIR1-IAA- AUX/IAA [11, 35]. Wczeœniej przypuszczano, e oddzia³ywania ligazy SCF TIR1 z AUX/ IAA zachodz¹ w nastêpstwie modyfikacji kowalencyjnych (fosforylacja, hydroksylacja, acetylacja) lub izomeryzacji cis-trans wi¹zania peptydowego po³o onego za jedn¹ z dwóch konserwatywnych reszt proliny w domenie II bia³ka AUX/IAA [36]. TIR1 wykazuje lokalizacjê j¹drow¹ i ma typow¹ budowê bia³ek FBP. Na C-koñcu ³añcucha polipeptydowego wystêpuje domena zawieraj¹ca 18 powtórzeñ leucynowych LRR (ang. Leucine Rich Repeat) wi¹ ¹ca auksynê i bia³ka AUX/IAA, natomiast na N-koñcu wystêpuje domena F poœrednicz¹ca w interakcjach z bia³kiem SKP1/ASK1 kompleksu ligazy E3. Domena F ma tak e wp³yw na zale ne od hormonu, tworzenie kompleksu TIR1-AUX/IAA, bowiem jej delecja lub mutacje punktowe w konserwatywnych resztach aminokwasowych obni aj¹ lub ca³kowicie znosz¹ powstawanie tych kompleksów [11, 35]. W genomie A. thaliana zidentyfikowano piêæ homologów TIR1, wykazuj¹cych 45 87% identycznoœci sekwencji aminokwasowej. Trzy spoœród tych bia³ek: AFB1-3 (ang. Auxin signaling F-Box protein 1-3) wykazuj¹ najwy szy stopieñ identycznoœci (61 72%). Podobnie jak bia³ko TIR1 zawieraj¹ one domenê LRR i wi¹ ¹ AUX/IAA w sposób zale ny od IAA. Bia³ka kodowane przez geny TIR1,

10 418 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ AFB1-3 wystêpuj¹ w nadmiarze i ka de z nich mo e byæ zast¹pione innym. Tylko poczwórna mutacja tir1/afb1/afb2/afb3 powoduje brak odpowiedzi na auksynê. Do chwili obecnej niewiele wiadomo na temat regulacji ekspresji genów TIR1/AFB. Nieliczne badania wskazuj¹ na udzia³ w tym procesie interferuj¹cych mikrorna (np. mir393) [11, 12]. Istotne znaczenie w aktywacji kompleksu ligazy ubikwityny SCF TIR1 ma opisany wczeœniej mechanizm rubinylacji kuliny. Uczestnicz¹cy w tym procesie enzym typu E1 sk³ada siê z dwóch bia³ek: AXR1 (ang. Auxin Resistant 1) i ECR1 (ang. E1 C-terminal Related 1), natomiast enzym E2 to bia³ko RCE1 (ang. Rub1 Conjugating Enzyme 1). Mutanty z defektami w genach AXR1 i RCE1 wykazuj¹ szereg zmian rozwojowych, a podwójne mutanty axr1/rce1 s¹ letalne. We w³aœciwym przebiegu degradacji bia³ek AUX/IAA bierze tak e udzia³ sygna³osom COP9/CSN zwi¹zany z procesem derubinylacji kompleksu SCF TIR1 [10, 54] Oddzia³ywanie bia³ka TIR1 z auksyn¹ Miejsce wi¹zania auksyny do bia³ka receptorowego TIR1 znajduje siê w specjalnej kieszeni utworzonej przez domenê LRR. Hormon przy³¹cza siê do hydrofobowego dna tej kieszeni poprzez oddzia³ywania hydrofobowe, van der Waalsa i wi¹zania wodorowe. W tym samym miejscu wi¹zane s¹ równie bia³ka AUX/IAA. Analiza modelowa receptora wolnego i zwi¹zanego z ligandem wykaza³a, e cz¹steczka hormonu nie zmienia kszta³tu TIR1, natomiast zachowuje siê jak klej molekularny (ang. molecular glue) zwiêkszaj¹c powierzchniê wi¹zania AUX/IAA do TIR1 i stabilizuj¹c oddzia³ywania miêdzy tymi bia³kami. W interakcjach TIR1-IAA bierze tak e udzia³ szeœciofosforan inozytolu (IP6), który jest œciœle zwi¹zany z TIR1. W³aœciwoœci oraz przestrzenne usytuowanie miejsca wi¹ ¹cego IP6 wskazuj¹, e pe³ni on prawdopodobnie funkcjê kofaktora TIR1 [63]. Oprócz IAA, bia³ko TIR1 wi¹ e tak e auksyny syntetyczne, jak np. kwas 2-4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) czy kwas naftylo-1-octowy (1-NAA), ale ich powino-wactwo do receptora jest ni sze [35]. Pod tym wzglêdem receptor TIR1 ró ni siê od receptora b³onowego ABP1, poniewa wykazano, e powinowactwo ABP1 do 1-NAA jest wy sze ni do IAA [5]. Z kolei antyauksyny, przez podobieñstwo swojej cz¹steczki do auksyn, konkuruj¹ z ni¹ o miejsce wi¹zania na receptorze. Wykazano, e antyauksyna zawieraj¹ca dodatkowy ³añcuch akrylowy w pozycji a w cz¹steczce IAA, wi¹ e siê do TIR1 w taki sam sposób jak IAA, jednak dodatkowy ³añcuch blokuje interakcje TIR1 z AUX/IAA [24]. Ostateczny rezultat dzia³ania antyauksyn zale y od stosunku ich stê enia do stê enia auksyn Ogólny model regulacji ekspresji genów przez auksyny Mechanizm aktywuj¹cy proteolityczn¹ degradacjê bia³ek AUX/IAA z udzia³em bia³ka TIR1 ma elementarne znaczenie w regulowanych przez auksyny procesach wzrostu i rozwoju. Przy niskim stê eniu auksyn lub ich braku, bia³ka AUX/IAA tworz¹ heterodimery z czynnikami odpowiedzi auksynowej ARF blokuj¹c w ten sposób ich aktywuj¹ce lub hamuj¹ce dzia³anie na ekspresjê pierwotnych genów odpowiedzi auksynowej (ryc. 4). Wysokie stê enie auksyn powoduje natomiast wi¹zanie hormonu do bia³ka TIR1 lub jego homologów przy udziale IP6, a nastêpnie

11 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 419 RYCINA 4. Mechanizm dzia³ania auksyn u A. thaliana (szczegó³y w tekœcie) FIGURE 4. Mechanism of auxin action in A. thaliana (for details see text) po przy³¹czeniu substratu powstaje kompleks TIR1-IAA-AUX/IAA. Do bia³ek AUX/ IAA zostaje do³¹czona ubikwityna przy udziale ligazy E3 regulowanej przez uk³ad rubinylacja/derubinylacja kuliny, bia³ko CAND1 i sygna³osom COP9/CSN. Degradacja bia³ka AUX/IAA prowadzi do uwolnienia z heterodimeru AUX/IAA-ARF odpowiedniego bia³ka ARF, które mo e aktywowaæ lub hamowaæ ekspresjê pierwotnych genów odpowiedzi na auksyny. Najwa niejsz¹ rolê w procesach wzrostu i rozwoju kontrolowanych przez auksynê wydaj¹ siê odgrywaæ bia³kowe produkty genów SAUR. Ekspresja wczesnych genów odpowiedzi auksynowej AUX/IAA jest natomiast elementem mechanizmu ujemnego sprzê enia zwrotnego dzia³ania auksyn, umo liwiaj¹cego zatrzymanie odpowiedzi w przypadku obni enia siê stê enia bodÿca. Podobnemu celowi s³u y tak e stymulacja ekspresji genów GH3, których produkty bia³kowe s¹ enzymami inaktywuj¹cymi auksynê przez koniugacjê z aminokwasami. Ten podwójny mechanizm ujemnego sprzê enia zwrotnego sugeruje istotne znaczenie wy³¹czania dzia³ania bodÿca auksynowego [55]. Istotn¹ cech¹ funkcjonowania opisanego szlaku sygna³owego auksyn jest wyraÿne skrócenie drogi jego przebiegu oraz bezpoœrednie powi¹zanie z procesem transkrypcji. Jawi siê to jako zupe³nie nowy mechanizm regulacyjny w dzia³aniu hormonów. Podobny przebieg szlaków sygnalizacyjnych obserwuje siê równie w przypadku jasmonianów i giberelin.

12 420 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ 2.2. Jasmoniany Jasmoniany to substancje organiczne powstaj¹ce w wyniku przemian kwasu linolenowego [70]. Po raz pierwszy wyizolowano je na pocz¹tku lat 60. z Jasminum grandiflorum, jednak dopiero na pocz¹tku lat 80. uznano je za jedne z wa nych regulatorów wzrostu i rozwoju roœlin. Odgrywaj¹ one istotn¹ rolê w kontroli wielu procesów, ale szczególnie wa ny jest ich udzia³ w reakcjach roœlin na stres biotyczny i abiotyczny [39]. Pocz¹tkowo zak³adano, e biologicznie aktywny jest wolny kwas jasmonowy JA (ang. Jasmonic Acid) i/lub jego lotny ester metylowy (JA-Me). Obecne badania dowodz¹, e bioaktywn¹ moleku³¹ jest koniugat JA z aminokwasem izoleucyn¹ JA-Ile. W literaturze polskiej mechanizm dzia³ania tego fitohormonu zosta³ szczegó³owo opisany przez Frankowskiego i innych w 2009 r. [19] Bia³ka COI1 i JAZ jako kluczowe elementy szlaku jasmonianowego COI1 bia³ko z domen¹ F. Badania percepcji i transdukcji sygna³u jasmonianowego sta³y siê mo liwe dziêki wyselekcjonowaniu niewra liwego na koronatynê mutanta A. thaliana coi1 (ang. coronatine insensitive 1). Koronatyna jest fitotoksyn¹ syntetyzowan¹ przez patogena roœlin Pseudomonas syringae, wykazuj¹c¹ du e podobieñstwo strukturalne i funkcjonalne do JA-Me i JA-Ile. Gen COI1 koduje polipeptyd bêd¹cy podjednostk¹ ligazy E3 typu SCF (SCF COI1 ), maj¹cy na N-koñcu domenê F, a na C-koñcu powtórzenia bogate w leucynê LRR. Mutacja w obrêbie domeny F, uniemo liwiaj¹ca oddzia³ywanie COI1 z bia³kiem ASK1 kompleksu ligazy, objawia siê utrat¹ wra liwoœci roœliny na jasmoniany [32, 33]. Bia³ko COI1 jest blisko spokrewnione z rodzin¹ TIR1/AFB. Podobnie jak w bia³ku TIR1, w strukturze I-rzêdowej COI1 obecne s¹ reszty hydrofobowych aminokwasów, które mog¹ tworzyæ kieszeñ wi¹ ¹c¹ hormon i bia³kowy substrat. Do dzisiaj nie ma jednak ostatecznych dowodów na to, e COI1 jest receptorem jasmonianów, ani czy do zwi¹zania hormonu wymagana jest obecnoœæ kofaktora, jakim w przypadku TIR1 jest IP6 [32]. Bia³ka JAZ represory transkrypcji. Substratem dla ligazy ubikwityny SCF COI1 s¹ zidentyfikowane w 2007 r. bia³ka JAZ (ang. JAsmonate ZIM-domain), które ulegaj¹ szybkiej degradacji w obecnoœci jasmonianów i s¹ represorami transkrypcji genów aktywowanych przez te fitohormony [7, 64, 76]. U A. thaliana zidentyfikowano 12 bia³ek JAZ (ryc. 5), z których JAZ1, JAZ3, JAZ6, JAZ10 wystêpuj¹ na terenie j¹dra komórkowego [7, 64], natomiast lokalizacja pozosta³ych nie jest dobrze okreœlona. Wszystkie one maj¹ w swej N-koñcowej czêœci 28-aminokwasow¹ domenê ZIM (ang. Zinc-finger Inflorescence Meristem) o nieznanej funkcji oraz 26-aminokwasowy motyw Jas na C-koñcu. Z uwagi na obecnoœæ w obrêbie domeny ZIM charakterystycznej sekwencji aminokwasów TIF[F/Y]XG, bia³ka JAZ nazywane s¹ te TIFY. Obecnoœæ funkcjonalnej domeny Jas jest niezbêdna dla oddzia³ywania bia³ek JAZ z COI1, bowiem mutacje w obrêbie tego motywu hamuj¹ proteolityczn¹ degradacjê bia³ek JAZ i prowadz¹ do ich nadmiernej akumulacji w komórce [59]. W przypadku JAZ3 wykazano jednak, e za interakcje z COI1 odpowiada N-koniec, a nie C-koniec bia³ka, co wskazuje na z³o onoœæ oddzia³ywañ miêdzy bia³kami JAZ i COI1 [7, 33, 76].

13 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 421 RYCINA 5. Porównanie budowy bia³ek z rodziny JAZ A. thaliana (za [7, 60, 68], zmodyfikowane, szczegó³y w tekœcie) FIGURE 5. Comparison of structure of JAZ family proteins in A. thaliana (according to [7, 60, 68], modified, for details see text) Bia³ka JAZ, podobnie jak funkcjonuj¹ce w szlaku auksynowym bia³ka AUX/IAA, nie maj¹ domeny, za pomoc¹ której mog³yby wi¹zaæ siê bezpoœrednio do DNA, dlatego swoje funkcje represyjne spe³niaj¹ przez tworzenie kompleksów z czynnikami transkrypcyjnymi Czynniki transkrypcyjne Analizy sekwencji nukleotydowych wykaza³y, e w promotorach genów regulowanych przez jasmoniany znajduj¹ siê charakterystyczne, szeœcionukleotydowe motywy typu G (ang. G-box) [7, 13]. Wszystkie one mog¹ byæ miejscem wi¹zania czynników transkrypcyjnych AtMYC2/JIN1 (ang. AtMYC2/Jasmonate INsensitive 1) zawieraj¹cych w swych cz¹steczkach domenê bhlh (ang. basic Helix-Loop-Helix). Bia³ka te, wi¹ ¹c siê z DNA, aktywuj¹ geny odpowiedzi na zranienia i stres oksydacyjny (m.in. VSP2, LOX3, TAT), a hamuj¹ jednoczeœnie aktywnoœæ trans-krypcyjn¹ genów odpowiedzi zwi¹zanych z obron¹ roœlin przed patogenami (m.in. PDF1.2, HEL) (ryc. 6) [13, 43]. Wspomniane grupy genów regulowane s¹ tak e przez czynnik odpowiedzi na etylen ERF1 (ang. Ethylene Response Factor 1), jednak e jego dzia³anie jest przeciwstawne. Geny, których aktywnoœæ jest hamowana przez ERF1, pod wp³ywem AtMYC2 ulegaj¹ aktywacji i odwrotnie. Biosynteza bia³ek ERF1, jak i niektórych innych bia³ek nale ¹cych do rodziny czynników transkrypcyjnych ERF, kontrolowana jest tak e przez jasmoniany [43, 44]. Oprócz AtMYC2 i ERF1 znane s¹ tak e inne czynniki transkrypcyjne uczestnicz¹ce w powstawaniu odpowiedzi na jasmoniany. Wœród nich mo emy wyró niæ m.in. zawieraj¹ce charakterystyczn¹ domenê WRKY, bia³ko WRKY70 funkcjonuj¹ce jako integrator szlaku jasmonianowego i salicylanowego oraz bia³ka ORA. Te ostatnie u A. thaliana s¹ one homologiczne do zidentyfikowanych u Catha-

14 422 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ RYCINA 6. Wspó³dzia³anie jasmonianów z etylenem i kwasem salicylowym w odpowiedzi roœliny na atak patogenów i zranienia: CEV1 czynnik transkrypcyjny ; ET etylen; MPK4 kinaza bia³kowa aktywowana mitogenem; OPDA prekursor jasmonianów; SA kwas salicylowy. WIPK kinaza bia³kowa aktywowana zranieniem (za [43, 46, 70], szczegó³y w tekœcie) FIGURE 6. Cooperation of jasmonates with ethylene and salicylic acid in the reaction on pathogen attack and wounding: CEV1 Constitutive Expression of VSP 1; ET Ethylene; MPK4 Mitogen-Activated Protein Kinase 4; OPDA jasmonates precursor; SA Salicylic Acid, WIPK Wound-Induced Protein Kinase (according to [43, 46, 70], modified, for details see text) ranthus roseus bia³ek ORCA. Spoœród ró nych bia³ek rodziny ORA u rzodkiewnika, ORA47 jest zale nym od COI, pozytywnym regulatorem biosyntezy jasmonianów, podczas gdy ORA59 i ORA37 dzia³aj¹ pozytywnie lub negatywnie na ró ne grupy genów zwi¹zanych z odpowiedzi¹ roœlin na warunki stresowe [70]. Blokowanie dzia³ania czynników transkrypcyjnych AtMYC2 nastêpuje przez fizyczne wi¹zanie jego N-koñcowej czêœci z C-koñcow¹ czêœci¹ bia³ka JAZ3 [7]. Jednak interakcje czynników transkrypcyjnych kontroluj¹cych aktywnoœæ genów odpowiedzi na jasmoniany z represorami transkrypcji JAZ s¹ ci¹gle ma³o poznane. Nie wiadomo np., jaka jest ostateczna liczba czynników transkrypcyjnych kontroluj¹cych te reakcje oraz czy wszystkie znane bia³ka represorowe JAZ bior¹ w nich udzia³.

15 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA Regulacja funkcjonowania szlaku jasmonianowego Przy niskim stê eniu jasmonianów lub ich braku, C-koñcowa domena bia³ek JAZ oddzia³uje z N-koñcem bia³ka AtMYC2, co bezpoœrednio blokuje dzia³anie tego ostatniego, natomiast pojawienie siê du ej liczby cz¹steczek sygna³owych prowadzi do proteolitycznej degradacji represorów JAZ i nastêpuje uwolnienie MYC2 z kompleksu JAZ-MYC2 (ryc. 7). Bia³ko MYC2 wi¹ e siê z sekwencj¹ JARE zlokalizowan¹ w promotorach licznych genów odpowiedzi na JA, wp³ywaj¹c na ich ekspresjê. Podobnie jak w przypadku auksyn, równie w szlaku jasmonianowym funkcjonuje mechanizm ujemnego sprzê enia zwrotnego s³u ¹cy do wy³¹czenia sygna³u w przypadku zmniejszenia siê stê enia hormonu. Mechanizm ten polega na aktywacji transkrypcji genów JAZ (np. JAZ3) przez czynnik transkrypcyjny AtMYC2 [7]. Funkcjonowanie szlaku jasmonianów regulowane jest tak e przez mechanizm dodatniego sprzê enia zwrotnego, w którym uwolnione z heterodimeru czynniki transkrypcyjne zwiêkszaj¹ aktywnoœæ transkrypcyjn¹ genów koduj¹cych enzymy biosyntezy kwasu jasmonowego [7, 8, 64]. Zrozumienie znaczenia tego mechanizmu wymaga jednak dalszych badañ. Regulacja szlaku jasmonianowego odbywa siê równie przez rubinylacjê/derubinylacjê kuliny. Mutacja w genie AXR1, którego bia³kowy produkt odpowiedzialny jest za rubinylacjê, jak i obni ony poziom funkcjonalnego kompleksu COP9/CSN, prowadzi do spadku lub ca³kowitego braku wra liwoœci na jasmoniany [34]. RYCINA 7. Mechanizm dzia³ania jasmonianów u A. thaliana (szczegó³y w tekœcie) FIGURE 7. Mechanism of jasmonates action in A. thaliana (for details see text)

16 424 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ 2.3. Gibereliny Gibereliny (GA) to tetracykliczne, dwuterpenoidowe kwasy karboksylowe, znane przede wszystkim z ich udzia³u w kie³kowaniu nasion, regulacji wzrostu pêdu na d³ugoœæ oraz indukcji kwitnienia u roœlin dnia d³ugiego [17]. Rodzina giberelin liczy ponad 120 substancji, ale tylko cztery z nich GA1, GA3, GA4 i GA7 wykazuj¹ aktywnoœæ fizjologiczn¹. Pozosta³e s¹ ich prekursorami lub produktami katabolizmu [47, 75]. Pierwotne doœwiadczenia nad mechanizmami dzia³ania giberelin wykonywane by³y na komórkach warstwy aleuronowej ziarniaków zbó. Komórki te, same nie zawieraj¹c wykrywalnych iloœci GA, reaguj¹ na fitohormon wydzielaniem enzymów hydrolitycznych, koniecznych do degradacji skrobi zmagazynowanej w bielmie. Jedn¹ z najszybszych odpowiedzi na gibereliny, do jakich dochodzi w komórkach warstwy aleuronowej, jest wzrost stê enia jonów wapnia w cytoplazmie. Wyniki badañ sugeruj¹, e w przekazywaniu sygna³u giberelinowego uczestnicz¹ tak e heterotrimeryczne bia³ka G, cykliczne nukleotydy oraz kinazy i fosfatazy bia³kowe [15]. Do dzisiaj nie uda³o siê jednak wskazaæ konkretnego receptora b³onowego, który móg³by wspó³dzia³aæ z tymi elementami w regulacji ekspresji genów odpowiedzi na gibereliny. Badania ostatnich lat pokaza³y natomiast, e podobnie jak w przypadku auksyn i jasmonianów, ogromn¹ rolê w powstawaniu odpowiedzi na gibereliny w komórkach roœlinnych odgrywa szlak sygna³owy zwi¹zany z aktywacj¹ ligazy ubikwityny (59) Represory odpowiedzi giberelinowej Postêpy w badaniach mechanizmów dzia³ania giberelin sta³y siê mo liwe dziêki wyselekcjonowaniu szeregu mutantów ry u i A. thaliana o zmienionej wra liwoœci na ten hormon. Doprowadzi³o to w konsekwencji do zidentyfikowania genów, których bia³kowe produkty, zawieraj¹ce charakterystyczn¹ sekwencjê DELLA, s¹ represorami odpowiedzi giberelinowej [4]. Budowa i funkcja bia³ek DELLA. Bia³ka DELLA, stanowi¹ce czêœæ licznej nadrodziny roœlinnych regulatorów transkrypcji GRAS (ang. GAI, RGA and Scarecrow) [15], maj¹ w swej cz¹steczce kilka konserwatywnych domen. Na N- koñcu polipeptydu znajduje siê 27-aminokwasowy motyw DELLA oraz sekwencja TVHYNP, które przedzielone s¹ niekonserwatywnym regionem (ryc. 8). Mutacja w ka dej z tych domen wywo³uje kar³owaty fenotyp, brak wra liwoœci roœlin na egzogenne gibereliny oraz mniejsz¹ wra liwoœæ na proteolityczn¹ degradacjê, co prowadzi do nadmiernej akumulacji bia³ka w komórkach. Kolejna sekwencja ps/t/v nie wp³ywa na stabilnoœæ bia³ek DELLA i okreœlana jest jako domena regulatorowa. Domeny LR (ang. Leucine Repeat) oraz VHIID odpowiadaj¹ce za RYCINA 8. Najwa niejsze domeny wystêpuj¹ce w cz¹steczkach bia³ek DELLA (szczegó³y w tekœcie) FIGURE 8. Most important domains of DELLA proteins (for details see text)

17 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 425 dimeryzacjê bia³ek, s¹ istotne w mechanizmach represji transkrypcji, jaka ma miejsce z udzia³em bia³ek DELLA [73]. Domena GRAS, wystêpuj¹ca na C-koñcu bia³ek DELLA, sk³ada siê z dwóch poddomen SH2 i SAW, za pomoc¹ których bia³ka te oddzia³uj¹ z bia³kami FBP wchodz¹cymi w sk³ad kompleksu ligazy ubikwitynowej SCF SLY1/GID2. Tworzenie kompleksu DELLA-FBP u A. thaliana nastêpuje w sposób bezpoœredni, natomiast u ry u potrzebny jest do tego dodatkowy czynnik [67]. W genomie A. thaliana znajduje siê 5 genów DELLA: RGA (ang. Represor of GA 1-3), GAI (ang. GA-Insensitive), RGL1 (ang. RGA Like 1), RGL2 (ang. RGA Like 2), RGL3 (ang. RGA Like 3), natomiast w genomie ry u jest tylko jeden gen SLR1 (ang. SLender Rice 1). Homologi genów DELLA zidentyfikowano równie u innych gatunków roœlin. Charakterystykê oraz funkcjê kodowanych przez nie bia³ek przedstawiono w tabeli 2. U A. thaliana bia³ka GAI i RGA s¹ g³ównymi represorami w czasie wzrostu wegetatywnego i indukcji kwitnienia, RGL1 i RGL2 odgrywaj¹ istotn¹ rolê w kie³kowaniu nasion, RGA, RGL1 i RGL2 wspólnie moduluj¹ rozwój kwiatu, natomiast funkcja RGL3 nie zosta³a do tej pory wyjaœniona [1, 30]. Udzia³ bia³ek DELLA w regulacji transkrypcji genów odpowiedzi na gibereliny. Przy braku lub w warunkach niskich stê eñ giberelin bia³ka DELLA ³¹cz¹ siê z czynnikami transkrypcyjnymi kontroluj¹cymi ekspresjê pierwotnych genów odpowiedzi na gibereliny, powoduj¹c hamowanie transkrypcji. Wzrost stê enia giberelin w komórkach aktywuje proteolitycz¹ degradacjê bia³ek DELLA w proteasomach, co prowadzi do uwolnienia wspomnianych czynników transkrypcyjnych i aktywacji genów [23] (ryc. 9). RYCINA 9. Mechanizm dzia³ania giberelin u A. thaliana (wiêcej szczegó³ów w tekœcie) FIGURE 9. Mechanism of gibberellin action in A. thaliana (more details in the text)

18 426 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ TABELA 2. Charakterystyka i funkcja bia³ek DELLA u wybranych gatunków roœlin TABLE 2. Characterization and function of DELLA proteins in selected plants species Gatunek Nazwa bia³k a Charakterystyka i funkcja bia³k a A. thaliana GAI syn. RGA2 ( Restoration of Growth o n Ammonia 2), 533 AA; w odró nieniu od bia³ek RGA s¹ mniej wra liwe na GA; hamuj¹ kie³kowanie nasion, wzrost wegetatywny i indukcjê kwitnienia AtGRAS-3 RGA syn. GRS ( GAI-Related S equence), R GA1 ( Restoration of 587 AA; spoœród wszystkich bia³ek DELLA s¹ najbardziej wra liwe na aplikacjê egzogennych GA, os³abienie transportu auksyn opóÿnia ich degradacjê indukowan¹ przez GA; hamuj¹ kie³kowanie nasion, G rowth on Ammonia 1), wzrost wegetatywny, indukcjê kwitnienia oraz AtGRAS-10 rozwój kwiatu RGL1 syn. AtGRAS AA; reguluj¹ rozwój kwiatu, uczestnicz¹ w kie³ - kowaniu nasion oraz w rozwoju zal¹ ka i pylnika RGL2 syn. SCL AA; funkcjonuj¹ jako g³ówne represory w ( SCarecrow-Like protein procesie kie³kowania nasion, reguluj¹ rozwój kwiatu 19), AtGRAS-15 (p³atki, prêciki, pylniki) RGL3 syn. AtGRAS AA, nieznana funkcja Oryza sativa SLR1 syn. OsGAI 625 AA Triticum R HT1( Reduced Height 623 AA aestivum p rotein 1) Zea mays D 8 (Dw arf-8) 630 AA Vitis vinifera VvGAI1 590 AA Hordeum S LN1 ( S Lender 1) 618 AA vulgare AA aminokwasy Najwczeœniej poznanymi czynnikami transkrypcyjnymi oddzia³uj¹cymi z bia³kami DELLA s¹ bia³ka GAMyb, choæ nale y zaznaczyæ, e ich funkcjonowanie budzi do tej pory wiele w¹tpliwoœci (15). Aktywuj¹ one ekspresjê genów enzymów amylolitycznych w komórkach warstwy aleuronowej ziarniaków zbó oraz genów zwi¹zanych z powstawaniem i rozwojem kwiatów zarówno u zbó [31], jak i u A. thaliana [45]. Spoœród kilku GAMyb znajduj¹cych siê w genomie A. thaliana, najwiêksz¹ homologiê do tego typu genów z ziarniaków zbó wykazuj¹ AtGAMyb33 i AtGMyb65. Wspóln¹ cech¹ bia³ek GAMyb jest obecnoœæ charakterystycznej domeny DBD, z³o onej z dwóch fragmentów R2 i R3. W obrêbie ka dego fragmentu zawarte s¹ trzy motywy tworz¹ce helisy, z których po dwie z ka dego fragmentu uczestnicz¹ w rozpoznawaniu specyficznych sekwencji DNA, okreœlanych jako GARE (ang. Gibberellic Acid Response Element). Sekwencje GARE z³o one s¹ z 21 nukleotydów i znajduj¹ siê w promotorach wiêkszoœci genów odpowiedzi na gibereliny [65]. Analiza funkcjonalna wykaza³a, e sekwencja GARE jest te istotna z punktu widzenia interakcji giberelin i kwasu abscysynowego. Innymi niezwykle wa nymi czynnikami transkrypcyjnymi, których aktywnoœæ jest regulowana przez DELLA s¹ bia³ka PIF (ang. Phytochrome Interacting Factors) [9, 16], nale ¹ce do rodziny czynników transkrypcyjnych negatywnie reguluj¹cych ró ne aspekty zale nego od œwiat³a rozwoju siewek. Bia³ka PIF hamuj¹ kie³kowanie

19 SZLAKI SYGNA OWE AUKSYN, JA I GA 427 [51], stymuluj¹ wyd³u anie hypokotyla [50] i kwitnienie oraz kontroluj¹ biosyntezê chlorofilu [23]. Maj¹ one trzy konserwatywne domeny: domenê APB, za pomoc¹ której mog¹ oddzia³ywaæ z fitochromem, domenê DBD oraz domenê bhlh, która bierze udzia³ w interakcjach bia³ko-bia³ko. Po raz pierwszy bia³ka PIF zosta³y zidentyfikowane jako elementy szlaku sygna³owego fitochromu B. W ciemnoœci wi¹ ¹ siê one z sekwencj¹ G (ang. G-box) znajduj¹c¹ siê w promotorach genów zwi¹zanych ze wzrostem siewek. Przekszta³cenie na œwietle fitochromu do aktywnej formy P fr powoduje jego transport do j¹dra i po³¹czenie z bia³kami PIF (m.in. PIF3 i PIF4) [3]. Wywo³uje to szybk¹ degradacjê tych bia³ek w proteasomach i w rezultacie zahamowanie transkrypcji kontrolowanych przez nie genów [50, 58]. Pod nieobecnoœæ giberelin bia³ka DELLA wi¹ ¹ siê z bia³kami PIF (PIF3, 4, 5), przeciwdzia³aj¹c wi¹zaniu do DNA. Przy braku œwiat³a dochodzi do wzrostu poziomu giberelin w komórkach, co poci¹ga za sob¹ aktywacjê proteolitycznej degradacji bia³ek DELLA, a tym samym uwolnienie bia³ek PIF i aktywowanie procesów etiolowanego wzrostu siewek [9, 16, 57]. Bia³ka DELLA nie maj¹ wyraÿnej domeny oddzia³uj¹cej z DNA, wydaje siê jednak, e mog¹ wp³ywaæ równie bezpoœrednio na transkrypcjê genów, tak jak inne bia³ka z nadrodziny GRAS, np. SHR (ang. SHort-Root) lub SCR (ang. Scarecrow) [40]. W tych przypadkach bia³ka DELLA zachowuj¹ siê jak aktywatory transkrypcji. Do genów aktywowanych przez bia³ka DELLA nale ¹ miêdzy innymi te, których produkty bia³kowe katalizuj¹ biosyntezê giberelin (GA20ox, GA3ox) oraz gen XERICO, którego produkt bia³kowy zwi¹zany jest z akumulacj¹ ABA. Aktywowana giberelinami proteolityczna degradacja bia³ek DELLA prowadzi do zahamowania aktywnoœci tych genów, a tym samym zatrzymania syntezy giberelin i akumulacji ABA. Co wiêcej, powoduje to tak e aktywacjê transkrypcji genu GA2ox, którego bia³kowy produkt odpowiedzialny jest za katabolizm giberelin. Aktywacja i deaktywacja genów GA20ox, GA3ox i GA2ox z udzia³em bia³ek DELLA jest elementem mechanizmu kontroluj¹cego homeostazê giberelin [78] Wi¹zanie bia³ek DELLA do kompleksu ligazy SCF SLY1/GID2 Pocz¹tkowo zak³adano, e przy³¹czanie bia³ek DELLA do kompleksu ligazy ubikwitynowo-bia³kowej jest spowodowane ich fosforylacj¹, glikozylacj¹ lub hydroksylacj¹ [36]. Ostatecznie jednak wykazano, e modyfikacje te nie maj¹ œcis³ego zwi¹zku z proteoliz¹ tych bia³ek [28]. Warunkiem koniecznym i wystarczaj¹cym do degradacji bia³ek DELLA jest ich po³¹czenie z kompleksem GA-GID1. Powsta³y agregat GA-GID1-DELLA jest nastêpnie rozpoznawany przez bia³ko FBP kompleksu ligazy SCF SLY1/GID2. Prowadzi to do szybkiego obni enia poziomu bia³ek DELLA, co umo liwia ekspresjê genów odpowiedzi na gibereliny [25]. Bia³ka z kaset¹ F kompleksu SCF SLY1/GID2. Bia³kami kompleksu ligazy, bior¹cymi udzia³ w oddzia³ywaniach z bia³kami DELLA, s¹ u A. thaliana SLY1 (ang. SLEEPY 1) i jego homolog SNE (ang. SNEEZY), a u ry u GID2 (ang. Gibberellin Insensitive Dwarf 2). Na N-koñcu tych bia³ek znajduje siê domena F, za pomoc¹ której oddzia³uj¹ bezpoœrednio z SKP1/ASK1 oraz poœrednio z pozosta³ymi sk³adnikami kompleksu ligazy kulin¹ i bia³kiem RBX1. Na C-koñcu

20 428 K. MARCINIAK, T. TUROWSKI, E.WILMOWICZ, K.FRANKOWSKI, J. KÊSY, J. KOPCEWICZ wszystkich bia³ek FBP, bior¹cych udzia³ w wi¹zaniu bia³ek DELLA, znajduje siê motyw LSL, uczestnicz¹cy w interakcjach miêdzy tymi bia³kami [77]. W odró nieniu od bia³ek FBP funkcjonuj¹cych w szlaku sygna³owym auksyn i jasmonianów, bia³ka SLY1, SNE czy GID2, uczestnicz¹ce w szlaku sygna³owym giberelin, nie wykazuj¹ zdolnoœci do wi¹zania cz¹steczki hormonu. Receptorem giberelin jest w tym przypadku bia³ko GID1. GID1 wewn¹trzkomórkowy receptor giberelin. Odkrycie receptora GID1 u ry u mia³o niezwykle istotne znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania szlaku percepcji i transdukcji sygna³u giberelinowego [48, 66]. GID1 koduje bia³ko o strukturze podobnej do zwierzêcych lipaz wra liwych na hormony HSL (ang. Hormone Sensitive Lipase) pozbawione jednak aktywnoœci tych enzymów, poniewa ma tylko dwie z trzech reszt aminokwasowych istotnych dla ich aktywnoœci katalitycznej. W cz¹steczce GID1 wystêpuj¹ dwa konserwowane motywy HGG oraz GXSXG, które s¹ niezbêdne do tworzenia kompleksu GA-GID1. Szybkoœæ wi¹zania GA do bia³ka GID1 wzrasta wyraÿnie w obecnoœci polipeptydu SLR1, a kluczowe dla oddzia³ywania tych bia³ek ze sob¹ s¹ domeny DELLA/TVHYNP bia³ka SLR1 oraz motyw HSL bia³ka GID1. GID1 wystêpuje przede wszystkim w j¹drze i nie stwierdza siê zmiany jego lokalizacji w zale noœci od stê enia fitohormonu [66]. U A. thaliana zidentyfikowano trzy geny AtGID1a, AtGID1b i AtGID1c [20, 48, 66], których bia³kowe produkty pe³ni¹ podobn¹ funkcjê jak GID1 u ry u. Zale na od GA interakcja pomiêdzy bia³kami AtGID1 i bia³kami AtDELLA u A. thaliana mo e zachodziæ. na wiele sposobów z ró nym powinowactwem w poszczególnych kombinacjach [20, 73]. Zrozumienie znaczenia tych interakcji wymaga dalszych badañ Porównanie szlaku giberelinowego ze szlakami auksyn i jasmonianów Szlak sygna³owy zwi¹zany z dzia³aniem giberelin ma podobny przebieg do szlaku auksynowego i jasmonianowego, wystêpuj¹ jednak pewne ró nice. Do zwi¹zania hormonu i aktywacji kompleksu ligazy ubikwityny nie wystarcza jedynie bia³ko FBP, jak w przypadku TIR1 i COI1, a konieczny jest jeszcze dodatkowy czynnik GID1. Bia³ko to po zwi¹zaniu gibereliny przy³¹cza siê do bia³ka substratowego przeznaczonego do degradacji i dopiero razem wi¹ ¹ siê do bia³ka FBP (np. GID2) kompleksu ligazy. Ró nica w mechanizmie dzia³ania hormonów polega równie na nieco odmiennym funkcjonowaniu bia³ek represorowych. Kiedy AUX/IAA oraz JAZ dzia³aj¹ jedynie jako bia³ka inaktywuj¹ce czynniki transkrypcyjne, bia³ka DELLA mog¹ równie wp³ywaæ na transkrypcjê przez bezpoœrednie wi¹zanie siê z DNA. W przypadku szlaku giberelinowego nie obserwuje siê równie istnienia pêtli negatywnego sprzê enia biosyntezy bia³ek represorowych. Wprawdzie w kie³kuj¹cych nasionach ekspresja genów GAI i RGA aktywowana jest przez dzia³aj¹cy w szlaku fitochromowym czynnik transkrypcyjny PIL5 (ang. Phytochrome Interacting factor3-like 5) [51], to jednak nie wiadomo, czy jego aktywnoœæ regulowana jest przez bia³ka DELLA. Podobnie jak w przypadku szlaku auksynowego, w szlaku GA funkcjonuje sprzê enie zwrotne, reguluj¹ce poziom hormonu. Poniewa bia³ka DELLA hamuj¹ aktywnoœæ genów GA2ox zwi¹zanych z inaktywacj¹ giberelin to indukowana przez GA degradacja bia³ek DELLA powoduje ich aktywacjê. Jednak e kontrola homeostazy giberelin jest znacznie bardziej z³o ona i zale na od wielu czynników, m.in. œwiat³a, czynników stresowych i rodzaju tkanki (75).