Organizacja jądra komórkowego

Transkrypt

1 Organizacja jądra komórkowego Wewnątrz jądra komórkowego * enzymy replikujące muszą odnajdywać miejsca inicjacji syntezy DNA, * czynniki transkrypcyjne i polimerazy RNA odnajdują promotory i enhancery, * czynniki splicingowe - miejsca wycinania intronów, * mrna pory przez które opuści jądro. Można założyć, że czynniki te swobodnie poruszają się w soku jądrowym, a przypadkowe spotkania z substratami doprowadzają do zajścia pożądanych reakcji.

2 Alternatywny model zakłada, że RNA jest transkrybowany na stałej platformie gromadzącej wszystkie enzymy potrzebne do transkrypcji, dojrzewania RNA i jego transportu (Wei i in. 1998). Istnieją powody do takiego myślenia: mitochondrialny łańcuch transportu elektronów zachodzi w takim uporządkowanym agregacie, a u bakterii enzymy syntetyzujące DNA skupione są na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Pytania: Czy w jądrze istnieje rodzaj retikulum, na którym znajdują się te enzymy? Jeśli istnieje, czy geny aktywne transkrypcyjnie lokują się na nim i czy są tam enzymy syntezy RNA?

3 jądro komórkowe jest wysoce uporządkowaną dynamiczną strukturą chromosomy zajmują określone terytoria chromosomowe

4 białka biorące udział w replikacji bądź transkrypcji grupują się razem w jądrowe fabryki kopiujące DNA bądź transkrybujące geny w przestrzeniach pomiędzy chromosomami znajdują się miejsca przechowywania białek biorących udział w dojrzewaniu RNA dynamiczna struktura, zwana macierzą jądrową (NM ang. nuclear matrix), aranżuje organizację jądrowego DNA i rozmieszczenie fabryk białkowych w przestrzeni jądra

5 NM jest strukturą widoczną albo po ekstrakcji solnej jąder trawionych nukleazą albo elektroforetycznym usunięciu z jąder fragmentów chromatyny w fizjologicznych warunkach jonowych cytoplazma NM (Capco et al., 1982) pow NM jest dynamicznym strukturalnym zrębem jądra złożonym z sieci włókien RNP połączonych z białkami laminy

6 włókna chromatynowe są zorganizowane w pętlowe domeny geny aktywne transkrypcyjnie znajdują się w pętlach chromatyny wrażliwych na DNazę I, dostępnych dla czynników transkrypcyjnych i maszynerii transkrypcyjnej geny nieaktywne są w bardziej zaplecionych obszarach chromatynowych u podstaw pętli znajdują się sekwencje DNA zwane S/MARami (ang. scaffold/matrix attachment regions), które wiążą się z białkami NM

7 model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej: * terytoria chromosomowe CT (ang. chromosome-territory) ** przestrzenie międzychromosomowe IC (ang. interchromatin compartment) a: CT mają kompleksowo ufałdowane powierzchnie olbrzymia pętla z kilkoma aktywnymi genami wystaje z powierzchni CT do przestrzeni IC b: CT zawierają oddzielne domeny dla ramion p i q chromosomów centromerów; geny aktywnie transkrybowane (kolor biały) są w pętli odległej od heterochromatyny centromerowej, a umieszczenie tych genów w heterochromatynie powoduje ich wyciszenie

8 model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej CT (ang. chromosome-territory) i IC (ang. interchromatin compartment) c: CT mają różną gęstość chromatyny: wysoką lub niską; luźna chromatyna wychodzi do IC, gęsta jest z dala od IC d: CT z 1 Mb domenami wcześnie i późno replikującymi; chromatyna uboga w geny lokuje się na obrzeżu jądra blisko laminy, jej wpukleń i wokół jąderka, bogata w geny - lokuje się pomiędzy przedziałami ubogimi w geny e: wyższorzędową strukturę chromatyny stanowi hierarchia włókien chromatynowych; geny aktywne (białe) znajdują się na powierzchni ufałdowanych włókien, geny wyciszone (czarne) mogą być wewnątrz struktur chromatynowych

9 model funkcjonalnej architektury jądrowej zawierającej CT (ang. chromosome-territory) i IC (ang. interchromatin compartment) f: model zakłada, że IC zawiera kompleksy (pomarańczowe kropki) i większe niechromatynowe domeny (skupienia pomarańczowych kropek)) transkrypcyjne, splicingowe, replikacyjne i naprawy DNA g: CT z 1-Mb domenami chromatynowymi i IC pomiędzy nimi, najmniejsze rozgałęzienia IC kończą się między 100-kb domenami chromatyny, geny aktywne (białe) są na powierzchni tych domen, geny wyciszone (czarne) wewnątrz nich, alternatywnie zamknięte 100-kb domeny z wyciszonymi genami zmieniają konfigurację na otwartą przed aktywacją transkrypcyjną

10 Cremer & Cremer, 2001 Mahy i in J Cell Biol 159: Terytoria chromosomowe dwa jasne terytoria 11p leżą pod powierzchnią jądra, użycie krótszej sondy odpowiadającej subtelomerowemu regionowi 11ptel zawierającemu wyłącznie aktywne geny np. IGF2 daje sygnał poza terytorium 11p (A) ludzkie limfocyty (B) ludzkie fibroblasty

11 Hipotetyczny model organizacji interfazowej chromatyny, pokazujący NM jako sieć wewnętrznych kanałów (Razin i Gromova, 1995.) Jądra komórkowe kurzych erytrocytów potraktowano DNazą I - wprowadza to 1-niciowe nacięcia w regiony chromatyny zawierające aktywne geny. Nacięcia naprawiono wewnątrz jądra przy użyciu metody nick translation w obecności fluorescencyjnie znakowanych nukleotydów. Fluorescencja pojawiła się pod powierzchnią jądra i wzdłuż struktur prowadzących od otoczki jądrowej w głąb jądra. (Hutchinson i Weintraub, 1985 )

12 zespół progerii Hutchinsona Gilforda (HGPS) autosomalna dominująca w 100% letalna choroba spowodowana mutacjami w genie laminy A (Eriksson i in Nature 423: 293-8) w spermatogenezie średni czas przeżycia 13 lat, zawały serca występują już u 5-latków Scaffidi i in PLoS Biol 3(11): e395. doi: /journal.pbio

13 Wyższorzędowa struktura genomu sama natura oddziaływań promotor enhancer nie zapewnia przestrzennej i czasowej specyficzności ekspresji genów specyficzność ustanawia chromatyna podział na domeny transkrypcja ze specyficznego promotora jest wynikiem aktywacji tylko poprzez enhancery położone w tej samej domenie chromatynowej

14 Model współistnienia w tym samym rejonie genomu fizycznie zachodzących, ale niezależnie regulowanych genów Hipotetyczny region zawierający dwa geny tkankowo specyficzne i jeden gen metabolizmu podstawowego (ang. housekeeping gene). Gen X (niebieski) ulega ekspresji w tkankach oczu, gen Y (fioletowy) w mózgu, gen Z (zielony) w każdej tkance. Tkankowo specyficzna aktywność transkrypcyjna zależy od utworzenia takiego centrum aktywnej chromatyny ACH, która obejmuje tkankowo specyficzne elementy cis ze związanymi kompleksami czynników i umożliwia wybiórczą interakcję z promotorem danego genu. Utworzenie ACH zapewnia lokalne wysokie nagromadzenie czynników transkrypcyjnych i czynników pozytywnie modelujących chromatynę. Aktywność genu metabolizmu podstawowego nie wymaga tworzenia ACH. Kleinjan DA, van Heyningen V 2005 Am J Hum Genet 76: 8 32.

15 Domeny chromatynowe i elementy graniczne transformacja egzogennego DNA do komórek linii hodowlanych lub transgeniczne zwierzęta służą do identyfikacji elementów cis, które zapewniają aktywację transkrypcyjną niezależnie od miejsca integracji w genomie zidentyfikowano 2 typy takich sekwencji: LCRy (ang. Locus Control Region) definiują aktywne domeny ekspresji genowej w sposób dominujący i są wymagane do tkankowo specyficznie regulowanej transkrypcji wielu genów u kręgowców elementy graniczne/izolatory (ang. insulator) to sekwencje, które zapewniają transkrypcję niezależną od pozycji poprzez izolowanie ekspresji genu od sekwencji sąsiednich

16 izolatory buforują ekspresję genu od represji/wyciszającego wpływu przyległej heterochromatyny En enhancer Prm promotor Ins - izolator

17 Model cis-regulacji zaktywowanego promotora Górny rządek: organizacja funkcjonalnych elementow genu. Enh - enhancer; Sil - silencer; Ins - insulator; Pro - promotor. Enhancer ze związanym białkiem p300 aktywuje transkrypcję, o ile białko CTCF nie wiąże się do insulatora i nie blokuje aktywności promotora. (CTCF powszechnie eksprymowane białko jądrowe z 11 palcami cynkowymi (ZF) wiążącymi się do DNA insulatorów. Mutacje puktowe w ZF3 i ZF7 korelują z szeregiem nowotworów, co sugeruje rolę CTCF jak supresora nowotworów.) Środkowy rządek: obszary z modyfikacjami lizyn (K) histonu H3 na zaktywowanym promotorze. Dolny rządek: rozmieszczenie nukleosomów (š) na zaktywowanym promotorze. Cecchini i in Semin Cell Develop Biol 20:

18 Efekt polarny izolatorów na oddziaływania promotor-enhancer Gerasimova & Corces 2001 Annu Rev Genet 35:

19 Inne (niż dostępność czynników transkrypcyjnych) mechanizmy regulacji transkrypcji mogące powodować otwieranie lub represję całych regionów DNA: * regulacja transkrypcji poprzez przyczepienie DNA do macierzy jądrowej * buforowanie przez izolatory * heterochromatynizacja/remodelowanie chromatyny * współzawodnictwo enhancerów w LCRach Jednym ze sposobów wykrywania udostępniania DNA dla czynników transkrypcyjnych (co oznacza brak blokowania przez upakowanie i/lub nukleosomy) jest badanie wrażliwości na DNazę I. Miejsca wrażliwe na trawienie nazywa się HS (ang. hypersensitive site) lub DHS (ang. DNase I hypersensitive site). Brown TA Genomy 2009 PWN

20 otrzymywanie macierzy jądrowej (NM) - ekstrakcja jąder komórkowych za pomocą: * LIS (ang. lithium-3,5 diiodosalicylate łagodny detergent) lub * TRITON X M NaCl (detergent+wysokie stężenie soli) S/MARy (ang. Scaffold/Matrix Attachment Region) sekwencje DNA o dużym powinowactwie wiązania NM; zwykle zawierają 70% par A+T; co najmniej 200pz; zakotwiczają pętle chromatyny w NM białka wiążące S/MARy: gr.i wiążą kooperatywnie (topoizomeraza II, laminy, hnrnp, histon H1) gr.ii rozpoznają specyficzne sekwencje (np. ARBP ang. attachment region binding protein) gr.iii rozpoznają regiony niesparowanych zasad w S/MARach (np. STAB1 i nukleolina) gr.iv wiążące DNA w sposób podobny do distamycyny wiążą rowek mniejszy sekwencji oligoa-oligot (np. HMGI/Y ang. high mobility group protein)

21 w genie lizozymu rolę izolatora pełni sekwencja SAR A CAT act. W przejściowej transfekcji (transgen na plazmidzie) miejsce SAR A ulokowane po obu stronach nie zwiększa ekspresji reporterowego genu CAT kierowanej przez sam promotor ani promotor-enhancer, jednakże interferuje we wzajemną interakcję promotora i enhancera, gdy znajduje się pomiędzy nimi ---A---PrCAT-A 5% ---E---PrCAT % A-E---PrCAT-A- 112% E-A---PrCAT % E------PrCAT % * W transfekcji stabilnej (transgen zintegrowany z genomem) miejsce SAR A zapewnia ekspresję niezależną od miejsca integracji, a poziom ekspresji odpowiada liczbie zintegrowanych kopii. Bez SAR A poziom ekspresji transgenu zależy od sekwencji flankujących miejsce integracji. * SAR A pełni rolę elementu granicznego dla funkcji enhancera.

22 MARy a regulacja locus β-globiny locus β-globiny składa się z genów 5 ε γ G γ A δ β 3, które ulegają ekspresji w sposób rozwojowo i komórkowo zależny (a) komórki, w których locus β-globiny jest wyciszony uważa się, że w hamowaniu ekspresji bierze udział przyczepienie regionu LCR/5'HS do NM, oddzielenie i wyciszenie tego locus wzmacnia przyczepienie dwu innych regionów pomiędzy LCRem a genem β-globiny (b) komórki z ekspresją genów ε γ G γ A w odpowiedzi na sygnał wyzwalający ich dojrzewanie uwalniane są z NM regiony pomiędzy LCRem a genem β-globiny uprzednio związane z NM, a domena chromatynowa ulega remodelowaniu.

23 NM a nowotwory Białka NM służą jako markery do odróżniania komórek normalnych i nowotworowych. Wykazano, że białka NM można wykryć w surowicy i moczu pacjentów nowotworowych. W metastatycznych komórkach mysich transformowanych onkogenem obserwowano duże zmiany kształtu jądra skorelowane ze zmianami w białkach NM. NM i czynniki transkrypcyjne Czynniki transkrypcyjne są zasocjowane z NM. Uważa się, że NM rekrutuje czynniki transkrypcyjne ułatwiając ich oddziaływanie z elementami regulatorowymi. W linii komórek raka sutka MCF-7 receptor estrogenu (czynnik transkrypcyjny istotny dla ich hormono-zależnej proliferacji) oraz HET/SAF-B (białko wiążące MAR będące represorem genu hsp27) są związane in situ z sekwencją MAR. Czynniki transkrypcyjne związane z NM in situ związane są też z MARami, a NM nie jest po prostu magazynem nieaktywnych czynników/kofaktorów.

24 NM a acetylacja histonów Dynamicznie acetylowane histony są powiązane z transkrypcyjnie aktywnym DNA. W kurzych komórkach erytroidalnych najbardziej dynamicznie acetylowane histony są związane z chromatyną, która prawdopodobnie jest przyczepiona do NM. Enzymy katalizujące acetylację HAT deacetylację HDAC histonów są związane z NM. Tylko regiony aktywnie transkrybowanej chromatyny są związane z NM poprzez wiele dynamicznych miejsc wiązania zapewne dzięki HAT i HDAC.

25 Traktowanie cisplatyną (chemoterapeutyk) ludzkiej linii komórek raka sutka sprzęga HDAC1 (enzym deacetylujący histony) z sekwencjami MAR, co sugeruje, że HDAC1 jest związany z MAR przy podstawie pętli. W kurzych erytrocytach, dynamicznie acetylowane histony H3 i H4 są selektywnie metylowane. Metylacja nie jest zależna od właśnie zachodzącej acetylacji i vice versa. Można przypuszczać, że enzymy HAT, HDAC i HMT kolokalizują w przestrzeni jądrowej.