Konstrukcja genetycznie modyfikowanych roślin

Transkrypt

1 Konstrukcja genetycznie modyfikowanych roślin

2 Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin Odkrycie struktury DNA Wyizolowanie polimerazy DNA z E. coli (można syntetyzować DNA in vitro) - Kornberg Odkrycie kodu genetycznego (poznanie zasad trójkowego kodowania informacji genetycznej) Crick

3 Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin Wyizolowanie ligazy DNA (możliwość łączenia między sobą fragmentów DNA) - Olivera & Lehman Izolacja nowego rodzaju enzymówenzymów restrykcyjnych (można ciąć fragmenty DNA w miejscach rozpoznawanych przez dany enzym) - Smith & Wilcox

4 Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin Otrzymanie pierwszego rekombinowanego DNA - połączono między sobą fragmenty DNA po ich przecięciu przez ER - Jackson i zespół Wprowadzenie obcego DNA do komórek E. coli przez zrekombinowany plazmid (możliwość namnażania biologicznego zrekombinowanego DNA w kom. bakterii) - Cohen i zespół Praktyczna metoda sekwencjonowania fragmentów DNA (rozpoczął się szybki rozwój metod sekwencjonowania DNA) - Sanger

5 Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin Otrzymanie pierwszej transgenicznej petunii z wykorzystaniem agroinekcji do jej transformacji (pracowanie powszechnie obecnie używanej metody transformacji roślin dwuliściennych) - De Block i in., Horsch i in Otrzymanie transgenicznego tytoniu metodą PEG (opracowanie metody transformacji poprzez bezpośrednie wprowadzenie DNA do protoplastów) - Paszkowski i in.

6 Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin Odkrycie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) Otrzymanie kukurydzy transgenicznej z zastosowaniem strzelby genowej (opracowanie metody transformacji roślin jednoliściennych) - Gordon- Kamm i in Pomidor transgeniczny Flavr- Savr na rynku USA (pierwsza roślina transgeniczna w uprawie) - Monsanto

7 Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych Pożądane zmiany w wegetatywnych częściach roślin bez znaczących zmian składu chemicznego generatywnych części zwiększenie tolerancji na działanie herbicydów, choroby wirusowe i grzybowe zmiany architektury roślin oraz terminu kwitnienia i dojrzewania zwiększenie tolerancji na stres środowiskowy

8 Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych Zmiany w składzie chemicznym i wartości użytkowej jadalnych części roślin - zwiększenie zawartości niedoborowych aminokwasów - projektowanie olejów roślinnych - poprawa cech sensorycznych produktu

9 Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych Synteza specyficznych, zazwyczaj gatunkowo obcych, substancji chemicznych produkcja farmaceutyków i szczepionek roślinnych zmiany kompleksu celulozowo-ligninowego oraz właściwości skrobi przydatnych w produkcji naturalnych biodegradowalnych opakowań zwiększenie zdolności wybranych roślin do kumulowania w glebie składników niepożądanych

10 Produkcja białek

11 SYSTEMY ROŚLINNE Powstanie biomasy wymaga jedynie energii słonecznej podłoża mineralnego

12 Transformacja organizmów wielokomórkowych Transformacja wszystkich komórek dorosłej rośliny nie jest możliwa. Transformacji ulegają pojedyncze komórki, z których roślina jest regenerowana

13 SYSTEMY ROŚLINNE Z 1 ha można otrzymać do 20 kg czystego białka W przypadkach, gdy preparat białkowy dostarczany jest drogą pokarmową brak konieczności oczyszczania białka

14 METODY WYTWARZANIA OBCYCH BIAŁEK W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH Ekspresja przejściowa wymaga wprowadzenia genu do ukształtowanego organizmu Ekspresja konstytutywna transformacja komórek roślinnych

15 Ekspresja przejściowa problemy do rozwiązania Jak równocześnie dostarczyć obcy gen do wielu komórek czy tkanek? Wirusy roślinne

16 Wirusy roślinne 99% wszystkich wirusowych patogenów roślinnych stanowią wirusy RNA niewielki genom (zwykle 6-10 tysięcy nukleotydów) występuje najczęściej w formie pojedynczej nici (u niektórych wirusów składa się z dwóch, trzech lub nawet czterech jednoniciowych RNA)

17 Wirusy roślinne - zalety Najprostsze wirusy kodują zaledwie kilka białek: niezbędną do replikacji genomu zależną od RNA polimerazę RNA (RdRp ang. RNAdependent RNA polymerase), białko umożliwiające systemiczną infekcję (MP ang. movement protein) strukturalne białko płaszcza (CP - ang. Coat protein)

18 Wirusy roślinne Dotychczasowe badania sugerują, że najlepszym materiałem do konstrukcji wektorów są wirusy o jednoniciowym genomie Wysoki poziom ich akumulacji w zainfekowanej tkance (do 8,6 mg wirionu / g świeżej masy) Naturalna zdolność do rozprzestrzeniania się i przełączania metabolizmu rośliny na wydajną syntezę (synteza miligramowych ilości białka/ g tkanki roślinnej) Synteza produktu w ilości 0.4-2% rozpuszczalnych białek rośliny

19 Wirusy roślinne zalety ułatwiające konstrukcję układów Możliwość manipulowania klonami cdna genomów wirusowych Niewielkie wymiary wirusów The structure of cowpea chlorotic mottle virus, a plant virus, in its open and closed forms, with a section of the capsid removed from the closed form to illustrate the interior cavity. This virus serves as a biotemplate for viral-based nanomaterials applications.

20 Wirusy roślinne zalety Możliwość wyboru momentu infekcji (podczas dowolnego etapu rozwoju rośliny) znaczenie przy produkcji białek toksycznych dla gospodarza Możliwość produkcji białek w roślinach jedno- i dwuliściennych

21 Wektory wirusowe (np. wius mozaiki stokłosy BMV) Genom wirusa mozaiki stokłosy BMV składa się z trzech jednoniciowych cząsteczek RNA (zwanych RNA1, RNA2 i RNA3) o polarności mrna.

22 Wektory wirusowe (np. wirus mozaiki stokłosy BMV) RNA1 i RNA2 kodują białka replikazowe odpowiedzialne za namnażanie genomowych RNA odpowiednie modyfikacje umożliwiające ekspresję obcych genów wprowadzone zostały w RNA3 Brome mosaic virus

23 Wektory wirusowe

24 Wektory wirusowe Photo credit: Ping Xu Drought-stressed rice plants after six days without water. The plant on the right is infected with Brome mosaic virus; the one on the left is "healthy" (i.e., virus free).

25 Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych

26 Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych Najbardziej rozpowszechniony sposób wytwarzania białek heterologicznych w roślinach

27 Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych sklonowany wcześniej gen wprowadzony zostaje do specjalnego plazmidu posiadającego zdolność do rekombinacji z genomem roślinnym (Ti-plazmid ang. Tumor inducing plasmid).

28 Agrobacterium tumefaciens naturalna transformacja roślin

29 Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Wykorzystanie do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych bakterii z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.

30

31 Agrobacterium tumefaciens

32 Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza.

33 Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego

34 Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Usuwając geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, można na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego organizmu. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens.

35 Agrobacterium tumefaciens Plazmid Ti 120 kb

36 Plazmidy pochodne plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens

37 Struktura odcinka T-DNA

38 Transfer T-DNA do komórek roślinnych Proces przekazywania T-DNA jest aktywowany, kiedy dochodzi do kontaktu A. tumefaciens z uszkodzoną tkanką roślinną T-DNA jest nacinane w miejscu RB, zachodzi replikacja jednoniciowego DNA do miejsca RB, a następnie powstałe fragmenty wnikają do komórek rośliny (vir)

39 Transfer T-DNA do komórek roślinnych

40 Transfer T-DNA do komórek roślinnych T-DNA integruje z genomem w przypadkowych miejscach Komórki, które uległy transformacji zaczynają dzielić się tworząc guzy Comparison of A. tumefaciens-induced crown galls on wild-type tomato (A and C) and the Never ripe (ethylene insensitive) mutant (B and D) stems.

41 Agrobacterium tumefaciens Geny vir i T-DNA mogą być dostarczane w dwóch oddzielnych plazmidach

42 Agrobacterium tumefaciens Zainfekowane komóki umieszcza się na pożywce zawierającej antybiotyk lub herbicyd Następnie z pojedynczych transformowanych komórek odtworzone zostają cale rośliny w procesie zwanym regeneracją

43 Badania roślin Czy gen ulega wydajnej ekspresji? Czy obecność genu/białka nie wpływa negatywnie na funkcjonowanie roślin (np. Uniemozliwi kwitnienie roślin czy owocowanie?

44

45 Transformacja roślin T-DNA integruje się w każdej komórce w innym miejscu genomu Insercja zachodzi w obrębie tylko jednej części chromosomu (insercja nie jest letalna rośliny - organizmy diploidalne)

46 W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu: Otrzymano szereg roślin transgenicznych, w których syntetyzowane są białka wirusowe (białko powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) białko otoczki wirusa klasycznego pomoru świń (CSFV) białka pasożytnicze (proteinaza kodowana przez motylicę wątrobową)

47 W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu: Wykazano, iż spożycie rośliny transgenicznej zawierającej antygen powierzchniowy HBV indukuje specyficzną odpowiedź immunologiczną mogącą chronić ludzi przed zakażeniem wirusowym. Obecnie prowadzone są analogiczne eksperymenty dotyczące immunogenności białka pochodzącego z CSFV i z motylicy.

48 Transformacja roślin Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem.

49 Metody bez wykorzystania wektora

50 Metody bez wykorzystania wektora 1. Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych. Niezbędnym etapem jest poddanie komórek roślinnych działaniu enzymu usuwającego ścianę komórkową. 2. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.

51 Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych Elektroporacja, fizyczna - polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.

52 Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych Mikrowstrzeliwanie, fizyczna - wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5-5 mikrometra (0, , metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.

53 Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych

54 Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna.

55 WPROWADZANIE OBCEGO DNA DO CHLOROPLASTÓW icongenetics.com/html/download.php?ityp=3&id=5913

56 Informacja genetyczna w roślinach Jądro komórkowe N Mitochondria M Plastydy (w zielonych częściach roślin chloroplasty) P

57 Genom chloroplastów Koduje ok. 120 genów kopii genomów chloroplastów (komórki liścia 100 chloroplastów, każdy zawiera 100 kopii)

58 Zalety produkcji białek w plastydach Nie zachodzi zjawisko wyciszania obcych genów Możliwość ekspresji kilku białek poprzez konstrukcję sztucznych operonów Brak możliwości niekontrolowanego przekazywania wprowadzonych genów przez pyłek

59 Transformacja chloroplastowego DNA użyciem systemu Genegun Transformation of the chloroplast genome by bombarding tobacco leaves with microprojectiles coated with DNA. Following bombardment, leaf discs are placed onto antibiotic-containing medium (panel A). Transgenic plants are regenerated from the transformed tissue that is able to develop green chloroplasts (panel B)

60 Transgeniczny ryż Czy r-białka otrzymywane w roślinach są bezpieczne? Transgeniczny bawełna

61

62 Rośliny transgeniczne, GMO - przykłady modyfikacji Modyfikowana sałata produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B została opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego - jest to przykład wykorzystania rośliny jako bioreaktora. W ten sposób można uzyskiwać także inne białka, enzymy, antybiotyki.

63 Aprotinin Inhibitor proteaz bovine pancreatic trypsin inhibitor Zastosowanie: redukcja ryzyka utraty krwi podczas operacji chirurgicznych Sposób podania: dożylnie AproliZeanTM (ProdiGene maize); ApronexinTM (produced by Large Scale Biology Corp. for Sigma Aldrich)

64 E.coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit (LT-B) Enterotoxigenic E. coli (ETEC) B podjednostka (LT-B) nie jest toksyczna. Wywołuje odpowiedź immunologiczną (szczepionka) LT-B produkowane w kukurydzy ma takie same cechy, jak oczyszczane z E. coli eksperymenty na zwierzętach szczepionka LT-B wydajna i bezpieczna badania kliniczne dobrze tolerowana

65 Charakterystyka potencjalnej możliwości wywoływania alergii

66 Laktoferryna wiąże żelazo, pierwiastek niezbędny do przetrwania dla wielu bakterii antyutleniacz aktywność anty-nowotworowa Ventria Bioscience ExpressTecTM production system for human LF (using crops of rice and barley); Meristem Therapeutics LF production from maize Tatura from New Zealand construct a new Lactoferrin plant for the manufacture of tons Lactoferrin per annum.

67 produkcja insuliny hodowla tkankowa Trypsyna TrypZeanTM bovine trypsin from transgenic maize (ProdiGene)

68

69 Ocena ewentualnych skutków ubocznych Układ krwionośny Układ oddechowy Układ trawienny Układ moczowy Układ nerwowy Wątroba Immunotoksyczność (w tym alergie) Kancerogenność i mutagenność Toksyczność dla poszczególnych organów Skóra Wpływ na zdolności rozrodcze

70 Rośliny transgeniczne przykłady Soja Rzepak Kukurydza Pomidory Ziemniaki Odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki Obniżenie zawartości kw. palmitynowego Odporność na herbicydy, Zmniejszona zawartość nienasyconych kw. tłuszczowych Większa zawartość kw. laurynowego Odporność na owady źródło żelaza Spowolnienie dojrzewania, większa trwałość Większa zawartość suchej masy, Intensywniejsza barwa, cieńsza skórka Wzrost zawartości skrobi Odporność na wirusy, herbicydy, stonkę ziemniaczaną Odporność na ciemnienie pouderzeniowe, większa trwałość

71 Rośliny transgeniczne przykłady Truskawki Buraki cukrowe Ryż Sałata Pszenica Dynia Banany Winogrona Seler, marchew Wyższa słodkość owoców, Spowolnienie dojrzewania Odporność na mróz Odporność na herbicydy, szkodniki Dłuższy okres przechowywania bez strat w zawartości cukru Zwiększona produkcja β-karotenu Produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B Zwiększenie zawartości glutenu Odporność na grzyby Odporność na wirusy i grzyby Odmiany bezpestkowe Zachowanie kruchości