Dr Anna Góra-Sochacka

Transkrypt

1 Rolnictwo molekularne Dr Anna Góra-Sochacka Patrycja Redkiewicz Prof. dr hab. Agnieszka Sirko

2 Tradycyjne Żywe zawierają żywe atenuowane (pozbawione zjadliwości) drobnoustroje Inaktywowane - zawierają zabite drobnoustroje (całe lub ich fragmenty) Nowej generacji Rekombinowane (żywy rekombinowany patogen) Rekombinowane podjednostkowe (białka, peptydy) DNA

3 Szczepienia są najbardziej korzystną z ekonomicznego punktu widzenia metodą ograniczenia zakażeń powodowanych przez choroby infekcyjne Bardzo duże zapotrzebowanie, ponad 30 mln dzieci nie jest szczepionych Tradycyjne szczepionki produkcja skomplikowana, kosztowna przechowywanie i transport w niskiej temperaturze

4 Idea wykorzystania roślin do produkcji antygenów szczepionkowych zrodziła się na początku lat dziewięćdziesiątych. Uzyskanie powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B w transgenicznym tytoniu pokazało, że organizmy roślinne są zdolne do produkcji antygenów. Pojawił się pomysł jadalnych szczepionek.

5 1997 rok (Goldstein) Getting vaccinated against diseases could soon be as easy as eating a banana Pierwotna koncepcja, ale brak kontroli dawki konieczność oddzielenia warzyw i owoców przeznaczonych do konsumpcji od tych dla celów terapeutycznych kontaminacje

6 Wybór antygenu, promotora, rośliny Łatwość transformacji Produkcja rekombinowanego białka w jadalnej (na surowo) części rośliny Wysoka zawartość białka w tkance, bo białko rekombinowane stanowi tylko mały procent Brak toksycznych produktów/metabolitów Zapewnienie odpowiedniej struktury antygenu i modyfikacji potranslacyjnych Rośliny: tytoń, jabłka, banany, pomidory, orzeszki, kukurydza, soja, sałata, kapusta, ziemniaki, szpinak

7 Wybór antgenu, promotora, rośliny 1. Transformacja roślin (stabilna lub przejściowa) 2. Wybór linii transgenicznej Namnożenie i uprawa w warunkach polowych lub przeskalowanie hodowli komórkowej Zebranie materiału, oczyszczenie rekombinowanego białka, standaryzacja dawki antygenu, forma podania i sposób (wstrzyknięcie lub doustnie). TESTY

8 Vibrio cholerae (bakteria Gram-ujemna) Antygen - podjednostka B toksyny (CTB) Tytoń chloroplasty 4,1% TSP Promotor CaMV35S, KDEL: 0,02%TSP Pomidor (Jiang et al., (2007) Transgenic res. 16: promotor E8; 0,081%TSP, (uzyskano wysoki poziom IgG i IgA u karmionych myszy) Ryż (Nochi et al., (2007) Proc Natl Acad Sci 104: Ziarna, promotor GluB-1: 30ug/ziarno (uzyskano przeciwciała po immunizacji doustnej myszy). CTB było stabilne w ziarnach przez 1,5 roku w temp. pokojowej

9 Antygen - podjednostka B termolabilnej enterotoksyny (LTB) Ziemniak, promotor 35S CaMV Karmione myszy LTB używany jako adiuwant LTB w fuzji z innymi antygenami Tytoń, ziemniak, kukurydza, pomidor, soja, marchewka, Arabidopsis thaliana

10 System ekspresji stałej

11 Dostępne szczepionki rekombinowane np. Engerix - rekombinowa szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B w postaci zawiesiny do wstrzykiwań zawierająca: - 10µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 0,5ml (dawka dla dzieci) lub - 20µg oczyszczonego białkowego antygenu HBs / 1ml (dawka dla dorosłych). Antygen powierzchniowy (HBsAg) wirusa zapalenia wątroby typu B Uzyskano w bardzo wielu roślinach: tytoń, ziemniaki, sałata i inne, zawiesinach komórkowych. Wykazano odp. Immunologiczna po podaniu doustnym u myszy i ludzi.

12

13 VLP virus-like particle

14 Fig. Anti-HBs secretory IgAs(S-IgAs) in feces extract (a) And total serum antibody response (b) to oral immunization with 100 ng/dose of VLP-assembled S-HBsAg. Mice were immunized with lyophilized plant tissue (ca. 9 mg dry weight/dose) or purified antigen,and delivered at 30- or 60-day timings. Non-transgenic lyophilized tissue or PBS were delivered to control mice at a 60-day timing. Anti-HBs antibody level (miu/ml) responses are expressed as arithmetic means with standard deviations (SD) from results for 10 BALB/c mice at pre-immune (5 days before prime) and 10 days after each immunization, determined twice by a Hepanostika kit (Organon Teknika, Boxtel). Statistically homogenous or significantly distinct responses for S-IgAs Or total serum antibodies aremarked by identical or different letter indexes, respectively (Tukey and Duncan tests, p<0.05, Statistica 6 )

15 Fig. a, b Plant-based prototype of anti-hbv vaccine specimens. a Preparation of plant-derived materials. Panels: left lettuce plants expressing 10 μg S-HBsAg/g FW; middle powdered lyophilized plant tissue as a semi-finished product for the preparation of various formulas of an oral vaccine; right tablets of 10 3 mm in size and 500 mg in weight, containing a specific dose of S-HBsAg. b The level of total and VLP-assembled S-HBsAg in powdered lyophilized tissue and 1 g and 1 unit of tablets, freshly prepared and stored for one year. S-HBsAg content was calculated in μg/g of dry weight (DW) as an arithmetic mean and standard deviation (SD) from ten polyclonal ELISA or monoclonal Auszyme assays

16 System ekspresji przejściowej

17 Są dwa rodzaje dopuszczonych szczepionek do stosowania u ludzi Inaktywowana składająca się z rozszczepionych wirionów grypy. Po namnożeniu odpowiedniego wirusa ulega on inaktywacji chemicznej lub fizycznej Żywa atenuowana, reasortanty wirusów szczepionkowych z wirusem o fenotypie cold adopted namnażające się wyłącznie w temp. do 33 o C, przy zablokowanej replikacji w 37 o C Są trójwalentne (H3N2, H1N1, wirus typu B) Są kosztowne i czasochłonne ( 6 miesięcy) Potrzebna jest szczepionka nowej generacji

18 NEURAMINIDAZA NA OTOCZKA LIPIDOWA BIAŁKO M 1 M 2 vrna HEMAGLUTYNINA HA NUKLEOKAPSYD

19 Antygen system wydajność immunizacja challange źródło HA , PS: PR- 1a tobacco, ER, His-tag H5N1 A/Barheaded Goose/Qinghai & A/Anhui/1/05 Transient; pgreen, N. benthamiana, Agroinfiltracja (vacuum), Cross-protection pomiędzy nimi, ale z 1 lub 2.1 brak Myszy Balb/c (dzień 0, 14, 28, Quil A, SC), dawki: 1-30µg; 2,5-5µg i 1 booster OK), HI +, VN + - Shoji Y, (grupa V. Yusibov z Fraunnhofer USA Center for Molecular BiotechnologyVaccin e 27 (2009) Jw., ale H5N1 A/Indonesia/05/05 HA0 H5N1 NIBRG-14 HA H5N1 A/Indonesia/05/05 HA H1N1 A/New Calzedonia/20/99 H1+M1 A/Puerto Rico/8/34 jw 60mg/kg FW Jw., dawka 90 lub 45µg 10 dni po ostatniej immunizacji, + MagnIcon provector system N. benthamiana, transient, vacuum Plasto promoter VLP Kierowanie do cyt., chloroplasty, apo. Oczyszczone 20-30mg/kg FW 50mg/kg Tabela 1 IM Myszy, IM, 0 i 21 dzien, H5VLP: 0,1, 1, 5 i 12µg zw 2%Alhydrogel K+ rekombinowana HA 5µg (oczyszczone z linii 293) HI +, wyższe niż K+ Kurczaki, Szczepienie, wirusem 96% podobieństwa, 3 tyg. Booster, 3 tyg. Challange + 0,5, 2,5, 7,5µg HA; Dzień 0 i 14, challange (A/Vietnam/1194/04, 75 dni po bosterze, 100% przeżywalności Jw. Kalthoff (ICON Genetics), J. of Vir. 84 (2010) D Aoust (Medicago); PBJ6 (2008)